IL-23和IL-17是临床上治疗几种Th17介导的自身炎症性疾病的关键靶点，包括炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD；仅IL-23）和银屑病（psoriasis，包括IL-23和IL-17）。

然而现有的抗体疗法仍有许多局限性，比如应答者由于产生抗药物抗体而随着时间的推移失去应答；抗体分子大，渗透性差，不能口服，只能通过静脉滴注或皮下注射给药；生产和运输成本高昂等。

使用计算设计IL-23R和IL-17的迷你蛋白抑制剂可以满足临床上治疗自身炎症性疾病对于有效、方便、安全和低成本的需求。

近日，来自美国华盛顿大学的David Baker教授团队在Cell上发表了题为 Preclinical proof of principle for orally delivered Th17 antagonist miniproteins 的研究论文，该研究利用计算设计生成了可拮抗IL-23R和IL-17的迷你蛋白，为蛋白设计领域再添力作。

这些具有抗体拮抗性质的迷你蛋白在具有亚皮摩尔亲和力的同时还具有极强的稳定性（耐热、耐酸和耐蛋白水解），可以口服递送，在体外实验和利用人源化小鼠结肠炎模型进行的体内实验中均表现出良好的治疗效果，极具临床转化潜力。

作者首先根据IL-23和IL-17的亚基组成（IL-23由p19和p40两个亚基组成，其中p40是IL-23和IL-12的共有亚基，p19是IL-23的特异性亚基；IL-17A同源二聚体是自身炎症性疾病的炎症介质）确定设计方向，计划设计可选择性阻断IL-23R与p19亚基相互作用的蛋白以及可结合到IL-17A蛋白表面阻断其与IL-17RA或IL-17RC相互作用的蛋白。

结合实验已知的和计算从头预测的配体-受体关键结合残基（hotspots），作者设计了上万个迷你蛋白，并使用Rosetta分子建模模块进行骨架优化。

在经过结合亲和性和单体稳定性计算筛选后，作者得到了针对IL-23R和IL-17A的各15000个目的蛋白，将其对应的编码序列转入酵母进行酵母表面展示（yeast surface display）。

随后作者将流式细胞分选得到的可以结合人源IL-23R和IL-17A的酵母库与未分选酵母库进行二代测序后比较编码序列的富集程度，得到了可结合IL-23R的两个迷你蛋白（23R-1和23R-2）以及可结合IL-17A的三个迷你蛋白（17-1、17-2和17-3），并通过生物膜干涉（biolayer interferometry，BLI）技术和圆二色性（circular dichroism，CD）实验验证了这些蛋白具有低纳摩尔亲和力和较高的稳定性（耐热和化学变性）。

随后作者通过点饱和突变（site-directed saturation mutagenesis，SSM）技术合成了23R-1、23R-2、17-1、17-2和17-3的所有可能的单位点突变体文库，同样进行酵母表面展示和流式分选和二代测序，得到了各个氨基酸位点的保守性评分。与上述计算机预测模型一致，设计模型中疏水核心或结合界面的氨基酸位置是保守的，而界面远端的表面位置则不保守。

为了进一步提高迷你蛋白对肠道蛋白酶的耐受性，作者首先利用SSM中的高亲和力突变体设计文库，通过连续多轮流式分选筛选高亲和力变异。

与初始设计相比，筛选得到的最高亲和力的IL-23R结合迷你蛋白的亲和力提高到原来的100-1000倍，IL-17A迷你结合蛋白的亲和力提高到60倍。

随后作者通过在上述高亲和力突变体中计算设计添加分子内二硫键以提高稳定性，并利用CD实验以及在模拟胃液和肠液（simulated gastric and intestinal fluids，SGF and SIF）中的定时降解进行稳定性评估以及SSM文库设计和筛选，最终得到稳定性最佳的突变体23R-72和23R-91。

此外作者还通过将两个最佳的IL-17A迷你结合蛋白单链（17-51）用灵活多肽连接（17-53）的设计，极大地提高了迷你蛋白和IL-17A的结合亲合力（avidity）和对IL-17A信号转导的抑制作用。

由于药物分子量影响肠通透性和组织弥散性，作者希望减小当前设计的7-8 kDa IL-23R迷你结合蛋白分子量，以增加口服给药后作用部位的药物浓度。因此作者分离出7-8 kDa迷你结合蛋白的中心结合螺旋的一小段（包括天然的Trp hotspots和de novo hotspots），然后将其嫁接到经过结构验证的26-32个氨基酸残基肽支架上，使用与上设计相似的计算指标对设计进行评估和筛选。

体外实验证明，上述迷你结合蛋白可阻断原代细胞培养和人类类器官中IL-23或IL-17介导的炎症。体内实验证明，口服给药后，IL-23R迷你结合蛋白在大鼠胃肠道和血清中可达到治疗相关浓度，并且口服IL-23R迷你结合蛋白在人源化结肠炎小鼠模型中与临床单抗一样有效。

总而言之，作者证明了从头设计的蛋白质作为口服治疗药物阻断Th17介导的炎症的潜力。该研究设计的7 kDa IL-23R迷你结合蛋白具有抗体样的拮抗效力和对热、酸和蛋白水解的极端抗性，其设计的IL-17A迷你结合蛋白的效力比临床单抗secukinumab高200倍。

这些迷你拮抗蛋白结合了小分子量易扩散到靶组织，以及高稳定性，高亲和力和遗传可编码性的优点，是作为口服生物制剂开发的有吸引力的候选者。

原文链接：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00631-7

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