纯化有道 | 抗体下游纯化酸性电荷异构体控制策略

抗体药物大多存在翻译后修饰且种类复杂多样，因此研发过程中的质量控制显得尤为重要。其中电荷异质性是关键质量属性（CQA），其可能影响生物制品的疗效，甚至有可能带来意想不到的副作用，从而影响药品的安全性和有效性，所以在抗体药物开发过程中需要重点关注并加以调控。抗体药物翻译后修饰是造成电荷异质性的主要原因，因此电荷异质性的控制是生物药工艺开发的一个重要挑战。

图1.抗体电荷异构体在 CEX-HPLC 上的宏观表现

电荷异质性可以宏观表现为：在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带；离子交换色谱图主峰前后出现小峰。这是由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性，所以，这种现象也被称为抗体的电荷变异。若是采用 CEX 分析（如图 1 所示），酸性变异体(Acidic Variants)则在主峰之前被洗脱，碱性变异体(Basic Variants)比主峰洗脱更晚，AEX 和 CEX 分析则相反。

当电荷变异超过一个 pH 单位时，会影响药物的组织分布以及药代动力学，表 1 总结了一些已经报道的电荷异构体对于疗效的影响。由此也可以看到增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除；降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清除。

表1.电荷异构体对药效/药代动力学的影响

研究者使用细胞发酵上清进行纯化，上清液中目的蛋白 EBI-005 的含量是 82.5%，HCP＜11000ppm。为了优化纯化的参数，研究者在 1 mL POROS XS 层析柱上做了 12 个 DoE 实验。具体实验细节如下，主要考察了洗脱液的 pH 和电导对 EBI-005 收率以及 HCP 去除的影响。图 2 结果表明，洗脱条件控制在 pH6.0，电导率 6.6 mS/cm 附近最佳。

• 填料：POROS XS

• 平衡液：10 mM acetic acid, 20 mM NaCl, pH 5.3

• 载量：35 mg/mL

• 淋洗液：100 mM MOPS, 20 mM NaCl, pH 5.7–6.8

• 洗脱液：100 mM MOPS, 118 mM NaCl, pH 5.7–6.8.

• 保留时间：2 min/CV

图2.（A）DoE实验的纯化图谱代表；（B）图谱A纯化样品的 SDS-Page 结果，泳道 1 是 Marker，泳道 2 是上样前，泳道 3 是流穿，泳道 4 是峰 1，泳道 5 是峰 2，泳道 6 是峰 3；（C）EBI-005 在主洗脱峰中的回收率等高线图；（D）主洗脱峰中HCP含量等值线图；（E）EBI-005 在主洗脱峰中的含量（CEX 结果）等高线图。

研究者在抗体 B 精纯去除酸碱峰时首先尝试了阳离子的结合洗脱模式，发现不仅载量低，且难以把控酸碱峰含量的一致性，需要进行两次切峰。将结合洗脱模式改变为置换后，进行 DoE 优化，使酸性电荷异构体在上样以及淋洗的过程中去除。优化后工艺如下：

• 填料：POROS 50HS

• 平衡液：50 mmol/L NaAC-HAC, pH5.5

• 载量：~ 50 mg/mL

• 淋洗液：NaAC-HAC, pH5.5, Cond 4 mS/cm

• 洗脱液：NaAC-HAC, NaCl, pH5.6, Cond 13 mS/cm

• 保留时间：5 min/CV

图3.（A）DoE 实验纯化图谱代表；（B）工艺优化后样品纯度

图 3 表明，使用阳离子层析置换模式可以在提高载量的同时减少不必要的切峰操作，从而稳定控制酸峰含量。

研究者发现，亲和捕获后，阴离子层析和疏水相互作用层析协同作用下具有去除酸性电荷异构体的潜能。如图4所示，（A）在阴离子疏水复合模式填料上采用 pH 电导率双梯度洗脱的方式，此时填料既发挥了阴离子交换的作用，也发挥了疏水相互作用，与（B）在阴离子疏水复合模式填料上采用 pH 梯度洗脱的方式，仅利用了阴离子交换作用相比，纯化结果基本一致。而（C）在阴离子疏水复合模式填料上采用电导率梯度洗脱的方式，在疏水相互作用下纯化结果与（A）和（B）差异较大，将清洁峰送检，发现酸性电荷异构体含量较高。因此，研究者在（D）实验中先降低电导率，然后降低 pH，分别收集样品送检，结果如表 2 所示，降低电导的样品中酸峰含量明显降低。

图4.（A）pH、电导率双梯度洗脱；（B）pH梯度洗脱；（C）电导率梯度洗脱；（D）先降低电导率，然后降低pH洗脱

表2.顺序洗脱中得出的 HIC 与 AEX 洗脱峰的产品质量分析

图：POROS 技术和明星产品里程碑

图. POROS 粒径电镜图 (左)、POROS 大孔结构电镜图(中)、优越分辨率(右)

图. 赛默飞层析填料产品产能扩增布局图，Bedford/Chelmsford/Greenville 是 POROS 离子填料相关工厂。