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关于酮式-烯醇互变化合物液相分析方法开发的几点思考

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药事纵横
分析方法
186
1个月前



摘要



作为药物分析人员,在液相分析方法开发阶段可能遇到过这样的化合物:化合物峰型展宽严重,甚至出现谱峰裂分情况。使出洪荒之力,悻悻然发现,该异常现象非溶剂强度过高所致,非主成分基质效应所致,非流动相pH不适所致,亦非高能σ键旋转瞬时形成多重构象所致。盯着化合物看半天,某个瞬间,目光中露出了然的神色,原来是这个家伙——酮式-烯醇互变化合物

酮式-烯醇互变化合物一般存在如下结构:羰基的邻位碳上即α碳上连接着具有酸性的α-质子。互变异构体是容易相互转化的结构异构体。  
          

酮式-烯醇互变化合物一般具有以下特性:

1)在酸性条件下,酮式结构会向烯醇式结构转化。其内在原理是:首先,羰基氧被酸质子化以形成氧正离子化合物,随后由酸引入的碱基会去除α-氢,这导致质子化羰基的π电子移动到氧上,形成烯醇产物的羟基,同时再生成外加的酸催化剂。


2)在碱性条件下,酮式结构同样会向烯醇结构转化。其内在原理是:首先游离的碱基会进攻具有酸性的α-质子,这导致羰基的π电子移动到α-碳上形成氧负离子化合物,随后结合质子,形成烯醇产物的羟基,同时再生成外加的碱催化剂。


3)在多数情况下,酮式结构比烯醇式结构具有更强的偶极距,故此,强偶极溶剂(也可叫做极性非质子溶剂,常用的有DMSO、DMF)有利于酮式结构的稳定,有助于烯醇结构向具有高偶极矩的酮式结构转化[1-3]。考虑到液相色谱中DMSO及DMF的强末端吸收以及二者较强的溶解粘度,一般较少应用于液相色谱当中。

4) 烯醇式结构由于存在羟基,故此,含有氢键受体的溶剂(一般含有孤对电子的原子如氧、氮均为较强的氢键受体)有利于烯醇式结构体的稳定,有助于酮式结构向烯醇结构转化[4, 5]。

5)随着温度的升高, 烯醇形成分子内氢键以及分子间的氢键作用力减弱,烯醇含量降低 [6]。

基于上述理论知识,分享如下案例。实际工作过程中遇到一个醛类化合物,尝试如下色谱条件下进行分析方法开发。以甲醇-水(30:70)为溶剂;用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(YMC-Triart C18 3.0μm,150mm×4.6mm);以甲酸-水(1:1000)为流动相A,甲醇为流动相B,按下表进行线性梯度洗脱。流速为每分钟1.0ml;检测波长为210nm;柱温箱温度为45ºC;进样体积为10μl。

线性洗脱梯度程序

目标化合物出峰情况如下所示。在不存在溶剂干扰的情况下,目标化合物,除了出一个明显的尖峰外,紧接着会出现一个展宽严重的色谱峰。将该溶液进行LC-MS鉴定,结果显示尖峰与展宽色谱峰对应的化合物具有相同的分子量。结合化合物的结构,推断二者互为酮式-烯醇式互变异构体,且尖峰为烯醇式化合物(具有更强的极性),展宽严重的色谱峰为酮式化合物。

图1空白溶剂及目标化合物色谱图

为解决这一问题,笔者尝试了两种解决方案,均得到了较为满意的结果。

解决方案1:为力求化合物以烯醇式单峰的形式出现,根据上文所述的酮式-烯醇互变化合物特性,将溶剂变更为等溶剂强度的乙腈-水-甲酸(50:50:0.1),将流动相B变更为乙腈-甲醇-甲酸(50:50:0.1),同时将柱温箱温度变更为20 ºC。减小流动相中甲醇的比例(由于存在其他杂质选择性的问题不能将流动相中甲醇全部替换成乙腈)以及将溶剂同步变更为乙腈的原因是乙腈为氢键受体,有利于与烯醇式结构中的羟基形成氢键作用从而增加烯醇式结构的稳定性;在溶剂以及流动相B中加入甲酸的原因是酸性体系下有利于酮式结构会向烯醇式结构转化;降低柱温箱温度的原因是较低低温有利于烯醇形成分子内氢键以及分子间的氢键作用力形成,从而增加烯醇式结构体的稳定性。变更流动相体系后,色谱图中获得了单一的尖锐色谱峰,从而问题得以解决。

图2变更色谱条件后目标化合物色谱图

解决方案2:我们知道含肼结构的化合物在酸性条件下可以同醛酮类化合物反应。其反应原理如下所示:


为了规避酮式-烯醇互变异构出现多重峰或异常峰的可能,笔者精密称定5mg的酮式-烯醇互变化合物,用高浓度(一般为试样浓度的100倍以上)的肼类化合物的弱酸性水溶液(可在肼类化合物水溶液中加入适量的磷酸)稀释制成每1ml约含50μg的溶液,于60 ºC下(一般选择50~80 ºC水浴)衍生20min。由于水合肼或硫酸肼无紫外吸收,且不会引入异源杂质干扰,故选择其为衍生化试剂。实验结果如下所示:

图3化合物衍生后色谱图

图4化合物与肼衍生产物结构示意图

由上,采用与上述相同的色谱条件2进行实验,仅在~5.1min出现一个相对于酮式和烯醇式极性更强的尖锐的色谱峰,而未出现~8.5min的烯醇结构化合物的色谱峰。故此推测,在该衍生条件下烯醇式化合物会全部转化为酮式结构化合物并与肼进行衍生,生成在酸性流动相体系中极性更强的碱性腙类化合物,其结构如图4所示。

以上仅为笔者的个人见解,不当或错误之处敬请同行指正。对于酮式-烯醇互变化合物存在多重峰的异常情况若有更好的解决方式也请同行不吝赐教。


参考文献
[1] Garland, E. W.; Nibler, J. W.;Shoemaker, D. P. Experimentsin Physical Chemistry, 7th ed. (and earliereditions); McGraw-Hill: New York, 2003; pp 453–461.
[2] Drexler, E.J.; Field, K. W. J. Chem. Educ. 1976, 53, 392–393.
[3] Spyridis, G.T.; Meany, J. E. J. Chem. Educ. 1988, 65, 461–462.
[4] Reichardt, C. Solvents andSolvent Effects in Organic Chemistry, 2nd ed; VCR: New York, 1988; p 2.
[5] Buemi, G.;Gandolfo, C. J. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2 1989, 85, 215–227
[6] 杨晓亮,等,有机化学研究简报,2005年第25卷,1279~1282


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