自CRISPR技术诞生以来，新型基因编辑工具层出不穷。可编程核酸酶、碱基编辑以及先导编辑等工具极大地丰富了人类的基因编辑工具库。令人遗憾的是，这些工具都存在一个共同的缺陷，即这些工具所能编辑的碱基片段通常小于200bp。此外，这些工具大多只能用于特定突变的序列，难以有效编辑未知或随机突变的序列。因此，科学家们与医生们需要一种能够插入大型基因的工具，以拓展基因编辑的泛用性。
近年来，科学家们发现了一种名为CRISPR相关转座酶 （CRISPR-associated transposases, CAST）的系统，能够在RNA引导下可编程整合大DNA片段。这种系统不会产生由核酸酶系统引发的双链断裂（DSB），因此可以规避DSB依赖同源定向修复所带来的限制与副作用。可这种系统此前仅在细菌中具有可观的活性，在人类细胞中的活性极低。
图片来源：Science
2025年5月15日，基因编辑巨擘刘如谦David Liu团队在Science上发表了题为Programmable gene insertion in human cells with a laboratory-evolved CRISPR-associated transposase的研究，报道了他们如何使用精细的实验室进化，得到了一种可以在人类系统中高效进行大DNA片段编辑的CAST系统，为CAST系统用于人类基因编辑奠定了基础。
在噬菌体中进化
为了实现对当前CAST系统的优化，研究团队使用了早年间开发的噬菌体辅助连续演化（phage-assisted continuous evolution）技术。这种技术通过引入定制化的回路，能够使得实验室内基于噬菌体的生物分子定向进化速度提高一百倍。
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在为CAST定制的PACE系统中，只有高转座子活性的CAST系统能够实现快速的噬菌体增殖，意味着研究团队只要找到增殖速度最快的噬菌体，就能得到编辑效率最高的CAST系统中所需的TnsA, Tns B以及TnsC元件（统称为TnsABC）。
但事情的开始并没有他们想的那么简单。由于这个系统的编辑效率过低，难以触发噬菌体增殖。为此他们不得不使用噬菌体辅助非连续演化（Phage-assisted noncontinous evolution, PANCE），以适当降低定向进化的筛选压力，并得到了第一个进化后的N1 TnsABC。
来源于N1的TnsABC已经具备了足够的活性，故研究人员开始正式使用PACE进行进化得到了P1，可得到的结果大多为假阳性。因此，研究者们不得不对进化回路进行了优化，并重新进行了一轮PANCE，得到了N2。随后在对回路进行新一轮优化后开始了PACE，并终于得到了P2的TnsABC。
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使用N1，N2，P1与P2四种突变体进行人类细胞基因编辑后，研究人员发现尽管P2有着最高的噬菌体扩增速度与质粒整合效率，可在人类细胞中的基因插入效率并没有N2高。进一步研究发现这种噬菌体扩增与人类基因编辑效率的差异是由于P2的TnsC在提高的噬菌体的活力的同时降低了基因整合的效率，这解释了为什么P2在高噬菌体扩增速度的情况下的人类基因编辑效率更低。
优中择优
在得到进阶版TnsABC后，研究人员将可能对基因插入效率有副作用的TnsC进行了固定，以此对TnsAB进行定向优化。在新的回路加持下，团队得到了在HEK293T细胞中有高标记效率的P1-3与N2-1，交替进行PANCE与PACE后，他们最终得到了N3与P3 TnsAB。对N3与P3 TnsAB进行功能表征后，作者们惊奇地发现具有转座子末端结合和转酯化催化功能的TnsB才是影响编辑效率的关键，所以他们进一步对TnsB进行了单独的定向进化，并最终获得了P4-15 TnsB。
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在P4-15 TnsB基础上再进行定向进化已经无法继续提高编辑效率，证明P4-15 TnsB已经触及了该研究系统的极限。与此同时，他们还发现P4-15 TnsB的编辑功能已不再依赖ClpX功能而实现基因编辑，而ClpX因具有较强的细胞毒性，限制了CAST系统的应用，这进一步加强了研究团队对P4-15独立用于人类基因插入的信心。
EvoCAST的诞生
在对P4-15 TnsB的分子结构进行了研究之后，研究人员开始着手打造一个最强的CAST系统。由于TnsB已经没有进一步优化的空间，他们对其他CAST组件进行了最后的优化。在对TnsA, TnsC以及另外一个关键组件QCascade复合体进行整体的优化与组合后，他们终于得到了能够用于人类基因编辑的超级工具，并将其命名为EvoCAST。
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EvoCAST在人类细胞中的基因编辑效率是原始PseCAST系统的540倍，且能够插入长达15kb的DNA。进一步研究表明EvoCAST能够将目标基因定点插入至互补RNA序列下游49bp的位置，并不会产生可检测到的插入或缺失（indels）。通过UDiTaS测序技术，研究团队对EvoCAST的特异性在全基因组层面进行了评估。发现EvoCAST的特异性与常见的基因编辑工具相似。
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在研究的最后，研究人员使用EvoCAST在多种不同的人类细胞进行了多种疾病相关基因的插入。例如可以用于治疗血友病B的ALB；用于治疗Rett综合征的MECP2；以及可以用于治疗苯丙酮尿的PAH等基因。
在人类细胞系中，EvoCAST对这些基因的插入效率在5-25%不等，远高于原始的 PseCAST系统，而PreCAST系统的插入效率仅为0.0093%到0.43%。在HeLa肿瘤细胞、成纤维细胞等其他细胞类型中，同样观察到较高的插入效率。这些数据再次证明了EvoCAST巨大的应用前景。
毫无疑问，EvoCAST的诞生是刘如谦团队利用PACE技术给基因编辑领域带来的又一力作，它的出现，推动了定向基因插入技术向人类临床治疗的转化迈出关键一步。
本研究中，人类密码子优化的野生型PseCAST基因由金斯瑞合成。
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参考资料：
1.Programmable gene insertion in human cells with a laboratory-evolved CRISPR-associated transposase | Science
2025-11-30
15页
浙公网安备33011002015279
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