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新一代细胞免疫疗法iNKT及其工艺流程解析

细胞与基因治疗领域

2024/09/26

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实体瘤 iNKT 细胞免疫疗法

近年来，CAR-T 细胞疗法在血液恶性肿瘤治疗中取得了显著成就，尤其在 CD19 阳性难治性或复发性B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者中，其完全缓解率高达 90%。然而，CAR-T 细胞疗法在实体瘤治疗中表现相对不佳。实体瘤微环境（TME）的免疫抑制特性严重阻碍了 CAR-T 细胞疗法的有效性。因此，为克服这些限制，不少科研人员希望突破一些新策略或新疗法^【1】。基于 iNKT 细胞的新一代细胞免疫疗法，则展示出良好的抗肿瘤潜力，有望在实体瘤领域大展拳脚。

图 1. iNKT 细胞发挥免疫效应示意图^【1】

iNKT 细胞（Invariant Natural Killer T Cell）属于非 MHC 限制性 T 细胞亚群，兼具 T 细胞与自然杀伤细胞（NK 细胞）的特点，能在免疫早期迅速分泌大量细胞因子，充当固有免疫与适应性免疫之间的桥梁（如图 1 所示），它们识别由 CD1d 分子递呈的特定脂质抗原，包括共生微生物、病原微生物来源的脂质以及部分自身抗原，且具有显著的抗肿瘤效应。研究表明，iNKT 细胞与癌症患者预后密切相关，且不受多态性 HLA 限制，有助于预防 GvHD（移植物抗宿主病），是异基因 CAR 疗法的理想载体，这些优势使 iNKT 细胞疗法成为癌症免疫疗法领域的新焦点^【1，2】。

图 2. 与 T 细胞与 NK 细胞相比， iNKT 细胞的优点^【3】。

iNKT 细胞治疗产品工艺流程，旨在从患者或健康供体体内分离出 iNKT 细胞，进行体外激活和扩增，最终获得足够数量且具有高度功能活性的 iNKT 细胞用于后续的免疫治疗^【4，5】。例如，MiNK 疗法的 iNKT 细胞生产流程如图 3 所示。

图 3. iNKT 细胞治疗产品工艺流程^【4】

血液样本收集：

通常从患者或健康供体的外周血中收集 PBMCs（外周血单个核细胞），这通常通过密度梯度离心法分离得到。

iNKT 细胞富集：

使用磁珠分选或流式细胞术分选技术，依据 iNKT 细胞表面标志物进行阳性选择或阴性排除，从而富集 iNKT 细胞群体。

体外扩增与激活：

将富集的 iNKT 细胞置于 37℃、饱和湿度、5% CO₂的恒温培养箱中进行扩培与激活，其培养基中往往需要添加特定的营养因子、激活剂等成分，例如 α-GalCer、IL-2 与 IL-25 等，其中，α-GalCer 作为 iNKT 细胞的主要激活剂，α-GalCer 可以与 CD1d 分子结合，进而激活 iNKT 细胞。IL-2 是 iNKT 细胞增殖的关键因子，通常在初始激活阶段以及后续培养过程中持续补充。IL-15 有助于维持 iNKT 细胞的增殖和存活。此外，在培养期间需定期监测细胞生长情况和活性，并根据需要调整细胞密度、更换新鲜培养基及添加生长因子。基于培养系统的可调控的生物反应器独具优势，文献详细说明了 T 细胞生产工艺的可扩展性开发^【7】。这种培养系统也可能用于扩增 iNKT 细胞。目前，大多数生物反应器设备都可配备传感器来实时监测培养体系的多种参数，传感器与工艺过程控制软件的结合可以做到对工艺过程的高效控制。

例如：Eppendorf 为高级生物过程控制开发的数据采集与监控系统软件包 DASware 软件套件，可实现下一代生物工艺过程信息高效管理，具有直观的用户界面、高级编程与实验设计功能，可高效完成过程监测、过程控制及其数据记录，能够实现生物反应器系统与实验室采样及分析设备的无缝集成，可方便地集成营养分析仪、细胞计数仪、生物量监测仪、质谱仪、自动化平台和自动采样仪、HPLC、拉曼光谱仪等众多设备，实现更好的工艺理解和工艺控制。

收获与冻存：

当 iNKT 细胞达到所需数量和活性时，进行收获。若不立即使用，可将细胞分装冻存，按照标准程序逐步降温至液氮储存。冻存细胞在需要时可解冻复苏，用于后续治疗。

目前，全球范围内，iNKT 细胞疗法已获得了越来越多科研团队和国际生物医药公司的关注与投资。例如：国内专注于 iNKT 细胞实体瘤治疗的代表性企业基因启明已完成中晚期肝癌 I/II 期临床研究，同时，基因启明在同种异体 iNKT 细胞、现货型 CAR-iNKT 细胞及 iPSC-iNKT 细胞产品方面处于临床前开发阶段。相对来看，国外的 iNKT 细胞疗法开发厂商数量较多，例如 Mink Therapeutics、Arovella Therapeutics、Kite&Appia Bio.等。其中，Mink Therapeutics 拥有 1 款进入临床 I/II 期的 iNKT 细胞治疗产品及4款处于临床前研发阶段的 CAR-iNKT 细胞治疗产品；Arovella Therapeutics 拥有 4 款处于临床前开发阶段的 CAR-iNKT 产品；Kite & Appia Bio 拥有两款处于临床前开发阶段的 CAR-iNKT 疗法^【6】。

尽管 iNKT 细胞疗法研究已取得不少可喜进展，但要将其更高效的转化为临床治疗手段，还需解决诸多障碍。例如，确保 iNKT 细胞在实体瘤内有效迁移、克服 TME 的免疫抑制作用、增强 iNKT 细胞的生存和增殖能力，以及优化 CAR 设计以增强其对肿瘤抗原的特异性识别和杀伤效能。

针对上述挑战，研究者们正在探索多种策略。其中，利用 IL-15 和 IL-21 等细胞因子来促进 iNKT 细胞的增殖、存活和功能增强受到广泛关注。IL-15 能够保护 iNKT 细胞免受肿瘤相关巨噬细胞抑制，增强其抗转移活性，而 IL-21 则具有双重作用，既能激活免疫系统，也可能导致免疫抑制。通过工程化手段将 IL-15 或 IL-21 信号传导元件整合到 CAR 结构中，有望提高 CAR-iNKT 细胞的抗肿瘤效果。此外，研究发现 iNKT 细胞亚群具有不同的功能和分化状态，了解并调控这些亚群的特性，有助于优化 iNKT 细胞疗法。例如，选择性激活特定 iNKT 细胞亚群、通过细胞因子受体复合物进行精确靶向、利用共刺激域如 4-1BB 优化 CAR 设计等，均可能提升 iNKT 细胞疗法的安全性和疗效^【1】。

综上所述，iNKT 细胞疗法作为一种新兴的癌症免疫治疗策略，兼具了 T 细胞与 NK 细胞的独特优势，有望克服传统 CAR-T 细胞在实体瘤治疗中的局限性，在未来成为治疗多种类型癌症的重要手段。

参考资料：

1. Liu Y, Wang G, Chai D, Dang Y, Zheng J, Li H. iNKT: A new avenue for CAR-based cancer immunotherapy. Transl Oncol. 2022 Mar;17:101342.

2. Delfanti G, Dellabona P, Casorati G, Fedeli M. Adoptive Immunotherapy With Engineered iNKT Cells to Target Cancer Cells and the Suppressive Microenvironment. Front Med (Lausanne). 2022 May 9;9:897750.

3. https://minktherapeutics.com/inkt-cells

4. https://investor.minktherapeutics.com/static-files/527a9717-09a0-484d-8757-30273595c1be

5. Li YR, Zhou Y. et al. Development of allogeneic HSC-engineered iNKT cells for off-the-shelf cancer immunotherapy. Cell Rep Med. 2021 Nov 16;2(11):100449.

6. https://mp.weixin.qq.com/s/FFIAH8jL8uPhHDxSmArlWQ

7. Eppendorf, Application Note 453, Optimizing CD4+ T Cells Long-term Expansion Process in the DASbox® Mini Bioreactor System: Impact of the Dissolved Oxygen