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吉玛AAV研究指南-生殖系统篇

吉玛基因

2024/12/09

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吉玛 AAV

一、生殖系统和AAV简介

生殖系统的器官有雌雄区别，但按其功能均由生殖腺、生殖管道和附属器官等组成。生殖器官通过其各种活动、受精、妊娠等生理过程，达到繁衍后代的作用。

AAV病毒载体的重要功能是实现体内组织特异性表达，生殖研究中已被广泛应用于基因递送，实现目的基因干扰、过表达以及细胞示踪。在本文将结合文献和研究数据经验，从AAV血清型和启动子的选择、注射方式、剂量等方面向用户详细介绍利用AAV病毒载体实现生殖系统特异性基因调控的方案。

图1. 生殖系统组成示意图 (来源于网络)

二、血清型和启动子推荐

已有很多研究测试了不同血清型对生殖系统的感染效果，常用血清型有AAV6和AAV9（表1）。其他如AAV1、AAV-DJ也可见于其他研究中。在生殖系统研究中还没有特别好的特异性启动子可供我们使用，但常规启动子如CAG、EF1a、U6等可供选用。

表1. 生殖系统研究常用AAV血清型

三、注射方法选择

由于生殖系统存在血睾屏障（BTB）或血-卵泡屏障（BFB），传统的尾静脉等系统注射方式，不能够高效地使AAV通过血液达到睾丸和卵巢区域。因此，在生殖系统研究中，应用更多的是局部注射方式，如卵巢显微注射、胎盘内注射、输卵管内注射、睾丸网注射、睾丸间质注射等，详见表2。

表2. 不同注射方式的作用区域和AAV参考剂量（小鼠为例）

1. 卵巢\输卵管显微注射

以小鼠卵巢（Ovary）注射为例，在最后一根肋骨的尾部约2毫米处做两个腹侧横切口。用细钳拔出卵巢。注意不要损伤血管和卵巢膜。轻轻抓住在输卵管和卵巢囊周围的脂肪垫，用显微注射仪推进移液管，并在卵巢白膜下插入玻璃针。通过添加少量台盼蓝来确认注射效果。向注射器装载AAV病毒液并完成显微注射。在一些实验中，添加神经氨酸酶（Sigma）可以提高转染效率。雌鼠在显微注射后至少2周再添加雄性。输卵管（Oviduct）位于卵巢附近，可参考上述方案，进行局部注射。

图2. 卵巢显微注射示意图[1]

2. 胎盘内注射

在胚胎第 15 天（E15）向小鼠胎儿的脑室内（i.c.v.）和胎盘内（IP）注射AAV9-EGFP ，追踪大脑和脊髓的神经元转导模式。所有注射均使用无菌34G Hamilton针以1 μL/10 s的速率进行。手术期间，通过使用温热的PBS溶液不断湿润胎儿。手术后，用含有头孢唑林（100mg/kg）的1 mL PBS填充腹腔，然后用0.5可吸收缝合线闭合切口。使用恒温垫预防小鼠手术期间体温过低。手术后，将小鼠放在单独的笼子里，并保持温暖1小时以上，直到麻醉剂的效果消失。为了预防疼痛，将美洛昔康（1.5mg/kg）加入饮用水中3天，每天监测小鼠直至分娩。注射后的幼崽至21天左右断奶；然后，他们的成长和健康状况被持续监测到成年。（见图3）

图3. 胎盘内注射（IP）注射示意图[2]

1. 睾丸注射（睾丸网注射、睾丸间质注射）

1) 睾丸网注射

常规方法麻醉C57BL/J小鼠，术区做好碘伏消毒。在耻骨联合上方做1.5cm的切口，拉出一侧睾丸和附睾。在体视显微镜下，将载有AAV病毒液的胰岛素针以<30度的角度插进睾丸网与输出管连接的凸起处，缓慢将转染液注入睾丸生精小管中。每侧睾丸网注射50μL病毒液，使得睾丸表面大部分生精小管被充分感染。完成注射后，停针2min，再拔针。

2) 睾丸间质注射

取6-8周龄小鼠，术前处理与前文相同。拉出单侧睾丸和附睾，在体视显微镜下，将载有AAV病毒液的胰岛素针，扎入睾丸间质，并完成注射，8~10μL/睾丸。4周后取材鉴定。[3]

图4. 睾丸与附睾结构图（来源于网络）

如图4所示，睾丸的被膜由外向内分为鞘膜脏层、白膜以及血管膜3层。纵膈处的CT深入实质将睾丸分隔成250左右的睾丸小叶（Testicular lobule）。睾丸小叶内含有生精小管（曲细精管），管道内形成精子。管道外的LCT中含有睾丸间质细胞，该细胞分泌雄激素。

四、案例解析

案例1. 小鼠卵巢

一篇题为“Adeno-associated-virus-mediated gene delivery to ovaries restores fertility in congenital infertile mice”的研究表明，采用血清型AAV9并通过卵巢显微注射，AAV能够穿透血-卵泡屏障（BFB）并感染颗粒细胞，在小鼠后代的基因组中未发现转基因整合，并且显示出正常的基因组印记模式。[1]

图5. 小鼠卵巢研究AAV使用推荐 [1]

如图5(A)所示，AAV病毒液通过显微注射至小鼠卵巢；图（B）是血-卵泡屏障（BFB）的功能评估结果。向WT小鼠卵巢间质注射FITC-葡聚糖（绿色）。显微注射30分钟后回收样品，用抗AMH抗体（红色）进行免疫染色以检测颗粒细胞，结果显示BFB对FITC-葡聚糖有隔离作用。图（C、D）分展示了不同血清型注射AAV-mCherry 1周后卵巢的外观（C）和组织学（D），白色箭头指示表达mCherry的细胞，说明AAV9型经过卵巢注射可以部分穿透血-卵泡屏障，达到目标区域实现基因表达。

案例2. 小鼠胚胎和输卵管

一篇题为“Direct Injection of Recombinant AAV-Containing Solution into the Oviductal Lumen of Pregnant Mice Caused In Situ Infection of Both Preimplantation Embryos and Oviductal Epithelium.”的研究表明，AAV6-CAG-EGFP经过输卵管内注射，可以有效感染桑椹胚以及输卵管，见图6。

图6. 小鼠胚胎和输卵管AAV6 使用效果参考 [4]

案例3. 小鼠睾丸

一篇题为“In Vivo Genetic Manipulation of Spermatogonial Stem Cells and Their Microenvironment by Adeno-Associated Viruses”的研究表明，AAV9-mCherry 经过睾丸网注射和间质注射，可以有效感染睾丸，作用区域分别为生精小管和间质细胞。[5]

图7. 小鼠睾丸AAV 使用推荐 [5]

五、参考文献

[1] Kanatsu-Shinohara M, et al. Adeno-associated-virus-mediated gene delivery to ovaries restores fertility in congenital infertile mice. Cell Rep Med. 2022 May 17;3(5):100606. doi: 10.1016/j.xcrm.2022.100606.

[2] Rashnonejad A, et al. Fetal Gene Therapy Using a Single Injection of Recombinant AAV9 Rescued SMA Phenotype in Mice. Mol Ther. 2019 Dec 4;27(12):2123-2133. doi: 10.1016/j.ymthe.2019.08.017.

[3] Zhang S, Yang B, Shen X, et al. AAV-mediated gene therapy restores natural fertility and improves physical function in the Lhcgr-deficient mouse model of Leydig cell failure. Cell Prolif. 2024; 57(9):e13680. doi:10.1111/cpr.13680

[4] Sato M, et al. Direct Injection of Recombinant AAV-Containing Solution into the Oviductal Lumen of Pregnant Mice Caused In Situ Infection of Both Preimplantation Embryos and Oviductal Epithelium. Int J Mol Sci. 2022 Apr 28;23(9):4897. doi: 10.3390/ijms23094897.

Watanabe S, et al. In Vivo Genetic Manipulation of Spermatogonial Stem Cells and Their Microenvironment by Adeno-Associated Viruses. Stem Cell Reports. 2018 May 8;10(5):1551-1564. doi: 10.1016/j.stemcr.2018.03.005.