1. 背景介绍
在药物有关物质分析过程中，计算结果时会经常遇到使用校正因子（Correction Factor , CF）或者相对响应值因子（Relative Response Factor, RRF）的情况，但有些分析员对CF和RRF的来源和应用还存有疑惑，本文将对CF和RRF的来源和应用进行详细的阐述，本文仅代表个人观点，如有不足之处，还请各位同仁指正。
2. CF和RRF的来源
高效液相色谱法定量的原则是在一定浓度范围内，物质的浓度或量与物质响应值呈一定的相关性。以物质浓度为横坐标，物质响应值为纵坐标，绘制标准曲线，见线性图图1和线性数据表1。
表1 线性数据
图1 线性图
从表1中，可以得出结论物质响应值/物质浓度可以近似为一个恒定的值，从图1中可以得出以该物质与物质响应值绘制的标准曲线相关系数为1.0000，因此该物质浓度在1-8μg/ml范围内，与物质响应值呈线性相关。根据上述的结论可以推导出，如果我们有该物质的标准品，即含量已知，那么在浓度1-8μg/ml范围内，就可以按照下面公式计算待测物质的样品含量：
Astd表示该物质标准品的响应值；Cstd 表示该物质标准品的浓度；Aspl 表示待测物质的响应值；获得以上3个数值后，我们就可以计算Cspl，即待测物质的浓度。该计算方法，在测定一种物质的含量时需要使用同一物质的标准品，被称作为外标法定量方式。在有关物质中，也会采用外标法定量。但由于有关物质标准品的可及性以及经济性问题，有关物质的标准品获取具有一定的局限性。这时便引入了校正因子和相对响应值因子。
从图1和表1中可以知道一种相同物质在一定浓度范围内，物质的浓度或量与物质响应值呈一定的相关性。但因为不同物质之间结构存在差异，所以在HPLC分析中，即使不同物质的量相同，响应值也存在一定的差异。但这种差异也存在一定的相关性，即CF和RRF。以主成分和杂质的线性数据建立标准曲线，见表2和图2。主成分的标准曲线方程为y=10010.7073x-70.1707，杂质的标准曲线方程为y=15102.9329x-186.5183，在检验操作误差和仪器误差可控且较小的情况下，截距可以忽略，所以两个方程可以，近似为y=10010.7073x和y=15102.9329x，方程中的斜率即响应值/浓度和表2中的结果进本一致。所以在浓度相同的情况下可以得出：
将该公式引入有关物质计算公式中即可进行相关杂质的计算，校正因子为主成分斜率/杂质斜率，计算时需要放在计算公式的分子部分，将杂质峰面积折算为主成分峰面积。而相对响应值因子为杂质斜率/主成分斜率，计算时需要放在计算公式的分母部分，将主成分的峰面积折算为杂质峰面积。
表2 主成分和杂质线性数据表
图2 主成分和杂质线性图
校正因子和相对响应值因子互为倒数，欧洲药典和中国药典中通常使用校正因子，美国药典通常使用相对响应值因子。其欧洲药典和中国药典通常采用带校正因子的主成分自身对照法，即对照溶液由供试品溶液稀释制得，定量时需要每份供试品溶液稀释制得自身对照溶液，而美国药典采用的是带相对响应值因子的主成分外标法，即对照溶液由标准品制备而得，在计算过程中需要对质量进行折算，详见表3内容。
3. CF和RRF的应用注意事项
CF和RRF的测定，应当覆盖方法的应用范围，一般从定量限（LOQ）水平开始，至限度水平的120%，建议可以将上限提高一些，使方法应用时可以更加灵活。CF和RRF为0.9-1.1之间时，可不再进行校正，此为药典要求，但在实际操作过程中建议采用实际值进行折算，避免出现所得结果在限度边缘出现超标的尴尬情况。药典中给定的CF和RRF通常为一位小数，对定量结果影响较大，因此建议采用保留两位小数进行校正。如果超过0.2-5.0范围时，说明两种物质响应值差异较大，此时定量的误差较大，建议采用杂质外标法进行定量。
除杂质外标法外，还有一种另外方式和大家分享下，某一项目有关物质为双波长方法，主成分和杂质A以及未知杂质均在波长A下测定，但杂质B在波长A下响应值较低，所以在波长B下测定并采用波长B下的主成分进行定量，方法源于USP，但在波长B下RRF值远远大于5.0，虽然是USP方法，但也是审评老师质疑了定量的准确性问题。后参考BP方法，在波长B在测试杂质B，使用波长A下的主成分，计算杂质B的含量，这样RRF既可落在0.2-5.0之间，并被审评老师所接受，见图3。
图3 杂质B定量方式的修订
在CF和RRF计算过程中，应当对标准品的纯度和盐基进行折算，以保证所得因子的准确性，此处非常非常关键，经常容易被忽略，望引起各位的重视。此外，各国药典方法中有时也会给定CF和RRF，测定时应与药典给定值进行比对，如果差异过大，因进行分析，是否杂质对照品不稳定或吸潮等，笔者在实际实验中确确实实遇到了类似的问题，如果杂质对照品不稳定或吸潮，应尽可能压缩采购周期，并限定好运输条件，到货后立即测定。CF和RRF通常只针对已知杂质，对于未知杂质，则不再进行校正。
4. 结论
鉴于当前审评尺度，有关物质方法中控制的杂质个数非常多，所以CF和RRF的应用越来越为广泛，CF和RRF会直接参与到杂质的结果计算，所以非常重要，为保证检测结果的有效性和准确性，对CF和RRF的研究一定小心并且要透彻，建议在实验室内部尽可能的考虑多因素进行测定，如不同仪器，不同人员，以便项目可以顺利申报注册，如果前期的研究工作不够彻底，从方法开发，验证，放行检测再到稳定性数据都会可能受到影响。最后，希望本文对您有所帮助！
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