对于每一个严重疾病患者来说，获得治愈都是他们最终的梦想！血友病患者也不例外，当控制凝血的级联反应在1964年被澄清时，人们乐观地认为，治愈血友病的目标将在5年内实现。许多个5年过去了，血友病的治疗虽然取得了长足的进步，但是治愈性疗法仍然未有出现。

不过，自成功克隆表达凝血因子VIII（FVIII）和IX（FIX）的基因以来，开发血友病治愈性疗法长达35年的征程近日有望结束。BioMarin公司开发的治疗血友病A的基因疗法valoctocogene roxaparvovec在今夏可能获得FDA批准，成为首款治疗血友病A的上市基因疗法。它能够为某些血友病患者提供显著的保护作用，并且达到功能性治愈的效果。

在治疗血友病的新纪元即将来临之际，世界血友病联盟（WFH）副总裁Glenn Pierce博士在Haemophilia杂志上撰文，在回顾血友病基因疗法开发历史的同时，阐述了我们对血友病基因疗法应有的态度。

自7岁时受邀在当地媒体上讲述血友病给自己带来的挑战以来，Pierce博士始终站在对抗血友病的前沿，并在过去60多年的生命中，实现了从一位坐在轮椅上饱受多个关节出血困扰的患者，到出任多家跨国药企血液学领域的重要负责人，推动5款血友病创新疗法诞生的角色转变。让他更与众不同的是，2008年在接受肝移植手术后他的血友病被治愈了。但不可否认的是，他仍然是血友病患者群体中的重要一员，2018年加入WFH后，他在该组织对发展中国家的人道主义援助工作中发挥了绝对关键的作用。

第一波血友病基因疗法：经验和教训

加州大学圣地亚哥分校的Theodore Friedmann博士和麻省总医院的Richard Roblin博士曾经在1972年《科学》杂志上发表文章，提出基因疗法未来可能成为治疗人类单基因遗传病的有力工具。随着编码FXIII和FIX的基因被克隆，用正常基因替换血友病患者细胞中失常基因的概念第一次看到了成为现实的可能。早期的基础科学研究使用逆转录病毒将表达FXIII和FIX的转基因导入动物的体细胞，然后将它们输注回动物体内。虽然这些实验取得的效果有限，但是足以支持这一领域的继续研究。

在1992年，美国国立研究院（NIH）首次举办了血友病基因疗法峰会（haemophilia gene therapy summit）。开发基因疗法的分子生物学家和病毒学家，与患者代言人和血友病治疗中心的医生们聚集一堂，合作探索治疗血友病的基因疗法。截至2005年，总计有5项血友病基因疗法进入临床试验阶段。

这些临床试验为血友病基因疗法的开发提供了宝贵的经验和教训。在费城儿童医院和Avigen进行的一项临床试验中，研究人员通过肝动脉注射，将表达FIX的转基因，使用腺相关病毒载体（AAV2）导入患者的肝脏细胞中。这是一个重要的先例，它使用血管内的递送方式，将表达FIX的转基因导入了天然产生FIX的肝细胞中。

然而，即使接受最高剂量的基因疗法，患者的FIX活性也只在接受治疗后的头4周内最多达到正常水平的12%，并且在随后几周完全消失。FIX活性的消失伴随着肝脏转氨酶水平的显著升高，而转氨酶水平在FIX活性回到基线之后也恢复了正常。这意味着所有能够生产FIX的肝细胞都被免疫系统消灭了！后续研究在患者体内发现了靶向病毒衣壳蛋白特异性氨基酸序列的细胞毒性T细胞。

这一发现导致了该临床试验的终止，也延缓了后续临床试验的启动。此后的研究发现，人体对AAV转染的免疫反应是一个非常复杂的过程，而且人类与动物模型（包括非人灵长类动物）之间对AAV产生的免疫反应的区别让动物模型无法有效预测人类临床试验中发生的免疫反应。这是从临床试验中学习到的重要一课。

由于很多人曾经受到过AAV的感染，他们体内已经存在了针对AAV的免疫力。这种已有的免疫力不但包括针对AAV衣壳蛋白的中和抗体，还包括针对AAV的记忆T细胞。当携带基因疗法的AAV载体进入人体时，这些已有的免疫力会严重影响人体产生的免疫反应的强度和质量。此外，AAV载体输注可能引起的先天免疫反应也可能促进适应症免疫反应的产生。因此，克服人体对AAV载体产生的免疫反应需要考虑AAV载体的血清型、组织特异性，载体本身的质量以及患者的独特先天免疫反应等多个问题。

“多管齐下”，维持凝血因子水平

基于早期临床试验获得的经验，治疗血友病的基因疗法无论是从AAV病毒载体的选择，转基因的设计，以及基因疗法给药之后的治疗流程上都做出了改进。以今夏有望获批的valoctocogene roxaparvovec为例，它使用的是AAV5病毒载体。AAV5的独特之处在于它与山羊的AAV同源性最高，而与灵长类AAV衣壳蛋白的同源性只有65%。由于人与山羊的接触较少，而且针对灵长类AAV的中和抗体与AAV5的交叉反应也较弱，这意味着人群中只有少数人携带能够与AAV5结合的抗体。

Valoctocogene roxaparvovec同时使用了肝细胞特异性启动子，这意味着基因疗法无需通过肝动脉输入到肝组织中，只需通过外周静脉输注仍然可以导致肝组织特异性表达凝血因子。这可以进一步降低基因疗法给药时造成的潜在组织损伤和因此激发的免疫反应。表达凝血因子的转基因的密码子也得到优化，进一步提高生成凝血因子的产量。

▲BioMarin血友病A基因疗法的转基因结构（图片来源：BioMarin官网）

Amit Nathwani教授、Edward Tuddenham教授和他们的同事在进行治疗血友病B的基因疗法临床试验时，开创了使用皮质类固醇抑制细胞免疫反应，并且潜在影响转染过程的治疗方案。这一方案后来在治疗血友病A的临床试验中也得到了应用。

基于这些改进，目前多款治疗血友病的在研疗法已经能够在临床试验中长期维持治疗水平的FVIII和FIX。BioMarin公司在今年的世界血友病联盟大会上刚刚公布了valoctocogene roxaparvovec的长期随访结果。在接受基因治疗4年之后，患者体内的FVIII水平仍然能够让他们不需要接受其它预防性治疗。

而在治疗血友病B方面，名为FIX Padua的突变体由于单个氨基酸的变异，将天然FIX的活性提升了6倍。这意味着原本只能表达5%正常水平FIX的基因疗法剂量可以在临床试验中将FIX活性提升到正常水平的30%~40%。目前，辉瑞（Pfizer）和uniQure公司治疗血友病B的基因疗法都已经处于临床3期试验阶段。uniQure公司的etranacogene dezaparvovec有望今年年底之前获得3期临床试验结果。该公司本月初刚与CSL Behring达成数额高达20亿美元的研发合作。

实现治愈的梦想，但是并非所有患者都能获益

即将获批的基因疗法具有给某些患者提供长期保护出血，甚至功能性治愈的潜力。然而，使用AAV递送FVIII或FIX的基因疗法并不完美，很多疾病患者还无法从中获益。例如，本来最有可能从基因疗法中获益的血友病儿童患者，却不适合接受基因疗法的治疗。因为AAV的基因组在细胞核中以染色体外的游离基因（episome）形式存在，它们会随着细胞的分裂而丢失，导致蛋白表达水平不断减弱。而在年幼的儿童中，肝脏生长的速度最快，到12岁时，他们肝脏的大小达到成人的三分之二。研究人员仍然需要进行临床试验来探明患者几岁时，目前的基因疗法无法提供长期保护。

而无法接受基因疗法治疗的最大患者群为体内已经携带针对AAV抗体的患者。目前大部分在临床试验中使用的AAV血清型来源于灵长类或者人类中分离的病毒株。它们的病毒衣壳同源性在85%左右。不同的AAV血清型之间存在着交叉反应，这意味着曾经受到过AAV2感染的患者，可能产生与AAV1、AAV3、AAV6、AAV8、AAV9和rhAAV10发生交叉反应的抗体。如果交叉反应产生显著的抗体滴度，那么患者无法接受使用这些AAV血清型递送的基因疗法。

目前，除了AAV5之外，大多数非灵长类AAV血清型无法有效转染人类细胞，因此高水平的已有免疫力是阻碍患者接受基因疗法治疗，或者接受基因疗法再度给药的重要障碍。

解决这一障碍的一个方法是使用不同的基因疗法递送系统。在这方面，使用慢病毒递送FVIII和FIX转基因已经在非人灵长类和狗的动物模型中获得成功。由于慢病毒可以整合到细胞基因组中，并且在人类中很少产生已有免疫力，这一技术平台具有相当的潜力。然而，慢病毒载体的生产仍然面对挑战，生产足够数量的载体来进行临床试验目前是研发人员需要解决的问题。

拥抱基因疗法的未来

在过去30年里，基因疗法已经取得了显著的进步，让血友病A和血友病B患者能够获得接近正常或正常的凝血因子活性。然而关于它的疗效和安全性，仍然有很多问题尚未得到解答。

Pierce博士表示，拥抱基因疗法作为“治愈”血友病的医疗模式，意味着在承认基因疗法存在的不确定性的同时，以毫不妥协的精神和坚持不懈的努力，追寻这些问题的答案。这将贯穿第一代血友病基因疗法在更多患者中逐渐得到应用的过程。