CNS疾病模型——热惊厥动物模型构建方法

Baram及其同事最先开发并改进了热吹风机模型^[2]。

1、动物：SD大鼠，10-11日龄（雌雄均可，对实验结果无显著影响）或C57BL/6小鼠，11-15日龄。

2、造模方法：将幼鼠放于玻璃容器中，并使用可调节吹风机将加热空气吹入容器，调节温度至40-45°C，距离容器底部2cm处测量温度，吹风机位置距离大鼠上方30-50cm（吹风机的位置可根据玻璃圆筒的高度和直径进行调整），容器底部放置一张滤纸，避免动物被直接加热。每3min测一次肛温，核心温度超过42.5°C，则将动物从玻璃容器中取出并转移到凉爽的金属表面，直到其核心温度降至39.5-42.5°C。通常热环境保持30min可诱导持续性惊厥发作。

3、实验装置：如图1-A所示，由玻璃容器高20cm、直径10cm，壁厚0.5cm，电吹风机距离底部30-50cm，微型探头肛温计，温度控制器共同组成^[3]。

图1. 吹风机（A）或红外灯（B）对啮齿动物进行热惊厥实验诱导的实验装置

（图源：Ryuta Koyama, Academic Press, 2017）

4、实验指标：记录放入热空气环境前的幼鼠肛温作为基线核心温度、惊厥发作时的肛温、惊厥发作潜伏期、发作持续时间。

5、文献参考：一篇文献中报道，用热吹风法诱导的大鼠幼鼠在造模时行为特征：突然停止移动，表现出强直性屈曲，并咀嚼后肢（图2-A所示）。恢复室温后立即从强直姿势和僵硬中恢复过来。热吹风法造模惊厥发作相关的指标如图２-（B-G）所示：

图２．TMEM16C敲除的大鼠幼崽更容易受到体温过高引起的惊厥发作的影响。

（图源：Wang TA,. Proc Natl Acad Sci USA. 2021.）

Holtzman等人^[1]开发了加热室模型。在这项研究中，惊厥发作时的大鼠肛温在P2时约为37°C，在P5时约为40-41°C，在P7和P10时约为43°C。与吹风机模型相比，加热室模型中动物体温的升高要慢得多，并且热疗引起的惊厥发作的潜伏期更长。

1、 实验动物：SD大鼠，8-11日龄。

2、 造模方法：把大鼠放置在有机玻璃室的纸巾覆盖的地板上。使用安装在腔室上方10cm处的250W红外灯升高大鼠幼崽的体温（使用小鼠时，距离为25-30cm），红外照射时间。

3、 实验装置：与热吹风机模型类似，不同之处在于玻璃容器上方使用了250W红外灯，用于创造热环境诱导动物热惊厥。如图1-B所示。

4、 实验指标：惊厥发作潜伏期、惊厥持续时间、惊厥发作时肛温、发作时严重程度评分、呼吸频率。

5、 文献参考：如下图3所示，在P8–P11和P22–P23大鼠幼崽中，红外灯热疗法下，随热疗时间增加导致动物体温及呼吸频率百分比变化：P8-P11大鼠（n =21）中，体温升高（从33.4 ± 0.9℃上升到41.8 ±0.7℃），同时呼吸频率增加；体温过高诱发当呼吸频率增加约60%时惊厥发作。在P22–P23组（n =14）中，暴露于高温导致体温升高至44.2 ± 1.1°C，呼吸频率增加28%；与P8–P11大鼠相比，P22–P23组大鼠经历55min的热疗没有诱发惊厥发作，表明热疗引起的幼鼠呼吸急促和惊厥发作具有年龄依赖性。

图3. 红外灯热疗引起的P8–P11大鼠幼崽（左图）和P22–P23大鼠幼崽（右图）的体温变化和呼吸频率变化。（其中：绿色条柱标记热疗诱发的惊厥发作开始到结束时间；红色条柱表示暴露在高热环境时间。）

（图源：Schuchmann S,. Nat Med. 2006）

在国外研究中，热水浴法用于构建热惊厥幼鼠模型的报道较少。耶鲁大学的研究人员曾利用45℃热水浴法处理大鼠幼崽研究热惊厥的神经病理学^[4]。在部分国内的一些研究中，使用热水浴法诱导大小鼠幼崽的热惊厥模型，并在该模型上进行不同药物的药效研究^[5，6]。下文以小鼠为例：

1、动物：C57BL/6小鼠，7-14日龄。

2、造模方法：玻璃水槽放置于加热的恒温水浴锅内，提前设置温度45℃，当温度计测定温度达到45℃后，将幼鼠放在水槽中提高幼鼠体温。使实验鼠站立在水槽中，水面高度使得实验鼠露出头部，足部不触及水槽底部即可，水浴时间至惊厥发作时止，可每次水浴诱导间隔24h，每天热水浴1次，连续7天。

3、实验装置：玻璃水槽（30cm×30cm×50cm）、温度计、恒温水浴锅。

4、实验指标：惊厥发作潜伏期、惊厥持续时间、惊厥发作时肛温。大鼠惊厥判断标准^[4]：0级：无惊厥；1级：面部抽动；2级：点头；3级：前肢阵挛抽搐；4级：全身强直；5级：全身强直阵挛。

5、文献参考：一篇中文文献报道，羚珠散灌胃给药7天在热惊厥小鼠幼崽中的治疗效果，如下表所示：与模型组比，羚珠散给药显著增加幼鼠惊厥潜伏期，且显著降低幼鼠热惊厥持续时间。

表 各组幼鼠惊厥潜伏时间及惊厥发作持续时间比较(mean ± SEM)

注:与空白对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01。

1、动物：C57BL/6小鼠，8日龄。

2、造模方法：热惊厥诱导模型：烘箱达到41℃后，将P8幼鼠放置到烘箱中诱导热惊厥^[7]。每5min测一次肛温，直到幼鼠出现高温诱导的惊厥发作行为特征：①全身性肌阵挛；②疯狂逃跑；③混乱行走；④转圈；⑤站立不稳，跌倒，四肢强直性阵挛。观察到第一次发作时，将幼鼠拿出烘箱放置到常温板上休息2min；再将幼鼠放回烘箱，诱导幼鼠第二次惊厥发作。分别记录第一、二次发作时肛温、发作潜时等指标。

3、实验装置：热烘箱。

4、实验指标：惊厥发作潜伏期、惊厥持续时间、惊厥发作时肛温。动物一旦出现跌倒、四肢阵挛的行为，则被认作第一次惊厥发作^[7]。

除常见的惊厥潜伏期，发作时肛温等实验指标，还可以通过使用脑电肌电（EEG/EMG）监测系统对发作时的动物脑电/肌电进行监测，如Aiba等人的报道中，对P40-P96小鼠进行脑电肌电记录^[9]。

图5. （A）去极化时及（B）发作时的小鼠EEG/EMG图及EMG能量分析图。

（图源：Aiba I,. JCI Insight. 2023）

实验小tips：

①  利用热水浴法造模时，注意不要让幼鼠呛水，尤其日龄较小的幼鼠，呛水容易导致其死亡。在实验观察结束后立即擦干幼鼠后放回饲养笼。

②  测量肛温时注意：拿幼鼠时注意动作轻柔使，使用尺寸合适的肛温计测量直肠温度，并在测量时将探头涂上甘油进行润滑，避免弄伤幼鼠。

③  饲养母鼠及幼鼠时，注意饲养环境保持安静和饲养物资充足。垫料如需换的话，建议每次更换一半。建议放一个纸屋以及卫生纸，利于降低母鼠焦虑情绪，让母鼠产生更高的安全感，有助于幼鼠的哺乳。