组蛋白变体H3.3的表达模式调控浆细胞分化

B细胞来源于骨髓中的造血干细胞（Hematopoietic stem cells, HSCs），在经过H链与L链的重排后，形成完整的IgM，然后从骨髓脱离进入脾脏或淋巴并分化为边缘区B细胞、滤泡B细胞和B1细胞。当被抗原或Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)配体激活时，这些B细胞分化为分泌抗体的浆母细胞，并进一步发展为浆细胞(两者都被称为浆细胞[plasma cells, PCs])。这个分化过程中，伴随着PCs特异表达基因（如IRF4、PRDM1和 XBP1）的上调和B细胞表达基因（如PAX5、BACH2、BCL6、SPI1和 IRF8）的下调。PCs分化由IRF4激活，IRF4后续激活PRDM1。BLIMP1则负责沉默B细胞谱系相关基因如BCL6和PAX5，从而解除这两个基因对于PRDM1的抑制作用。XBP1协调多种分化过程，从而促进浆细胞分泌抗体的能力的成熟（图 1）。

图 1. 成熟B细胞的分化过程^[1]

在B细胞终末分化的过程中同时伴随着表观遗传修饰的改变，如DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰将发生动态变化。比如DNA甲基转移酶TET蛋白的缺失导致生发中心（germinal centers, GCs）的B细胞受损并影响PCs的分化。而组蛋白变体在这过程中也会对PCs的形成产生影响。大部分哺乳动物的组蛋白H3可分为经典的H3家族和非经典的H3家族。其中H3.3属于非经典的H3家族，由H3F3a和H3f3b两个基因共同编码而成。H3.3在序列上与经典的H3家族的H3.1仅仅有5个氨基酸序列的差异，但在功能上就有很大不同。非细胞周期依赖的H3.3参与很多转录活性的调控，已有研究发现，HSCs中缺失H3.3将无法正常产生B细胞。

在文章中，研究人员揭示了H3.3对B细胞分化到PCs过程中的影响，并发现PCs分化后H3.3的表达量和基因组上的位置均有变化，并且PCs与B细胞有着不同的染色质可及性的分布。外源表达H3.3将抑制B细胞分化为PCs，并且这种现象是由于调控分化相关基因导致的。

研究人员首先从小鼠脾和骨髓中分离出的未分化的带有杂合Blimp1^gfp/+基因的B细胞与PCs细胞，通过检测H3.3和H3.1\H3.2的mRNA水平，发现B细胞在分化到PCs后，H3.3的mRNA水平有明显的下降，但H3.1\H3.2在分化过程没有明显变化（图 2a）。在将脾脏中分离出来的B细胞用脂多糖（LPS）诱导分化后也观察到了H3.3的下降（图 2b, c）。再利用cell trace violet（CTV）将已激活并进行细胞复制的B细胞与PCs细胞分开，对H3.3的表达水平的检测发现，激活的B细胞存在H3.3的上升，但PCs细胞中存在H3.3的下调（图 2d, e）。这说明在分化过程中H3.3起到一定的调节作用。

图 2. PCs分化过程中H3.3表达减少

研究人员利用chromatin integration labeling sequence (ChIL-seq)对LPS刺激后的各个阶段的B细胞与PCs进行了检测。结果表明，在分化过程中，H3.3峰的富集减少（图 3a），并且在PCA分析中也表现出了这种动态变化（图 3b）。虽然H3.3在PCs中整体含量下降，但是在PCs中启动子区域的富集增加（图 3c）。在motif分析中，发现在活化的B细胞中H3.3有偏好的富集在Bach2基因上，而在PCs中则富集在Prdm1上（图 3d）。在Xbp1和Jchain基因上，H3.3的富集发生了动态增加，而在PCs中高表达的Irf4和Prdm1上，H3.3的表达保持不变（图 3e）。

研究人员又利用ATAC-seq检测了染色质开放性的变化。PCA分析发现，在分化过程中染色质可及性整体发生了变化（图 3f），但ATAC-seq的分布在激活的B细胞中与PCs没有明显变化（图 3g）。在对DARs区域分析时，结果表明整体上染色质可及性区域存在差异（图 3h）。PCs分化中特异性关闭的区域（naïve-open）的H3.3信号在PCs中要少于初始B细胞，PCs分化中特异性开放的区域（open-PC）的H3.3信号在PCs中与初始B细胞中没有明显变化（图 3i, j）。在对DAR上富集的H3.3进行GO分析，发现与多种生物过程相关，其中包括B细胞的成熟（图 3k）。上述研究表明，H3.3在PCs分化过程中与调控基因表达、染色质开放性变化相关。

图 3. PC分化过程中H3.3沉积及染色质可及性的动态变化

首先研究人员构建了能够外源表达GFP-H3.3和GFP-H3.1的B细胞，观察发现GFP-3.1会定位在异染色质区域，而GFP-H3.3能够定位在常染色质区域（图 4a）。将B细胞诱导分化成为PCs后，外源的H3.3表达水平下降，而H3.1的水平没有明显变化（图 4b）。IgM的总含量的变化与流式的结果一致（图 4c）。由于PCs分化依赖细胞增值，在使用CTV检测细胞复制的实验中发现H3.3的外源表达不影响细胞的增值（图 4d）。并且外源表达H3.3的PCs在LPS诱导后正常存活（图 4e），这说明外源表达H3.3造成的PCs分化减少不是因为细胞增殖或者细胞凋亡。在体内实验中，将GFP-H3.3的B细胞注射入LPS诱导一天前的μMT小鼠中，并取脾进行分析发现，外源表达H3.3能减少PCs的数量（图 4f）。以上结果表明H3.3的表达将抑制PCs的分化。

图 4 外源表达H3.3抑制PCs的分化

在H3.3与H3.1存在差异的序列中，S31（在H3.1中为A31）位点在有丝分裂时会被磷酸化，而在α-螺旋2的底部有三个碱基A87/I89/G90（即AIG序列，在H3.1中为S87/V89/M90）会与组蛋白伴侣如DAXX、ATRX和HIRA结合。因此研究人员将H3.3的碱基进行突变，将外源携带碱基突变S31A、A87S、G90M、和A87S/I89V/G90M的GFP-H3.3的B细胞诱导为PCs细胞（图 5a），携带A87S、G90M、和A87S/I89V/G90M突变的外源表达GFP-H3.3细胞能够正常分化为PCs，而携带S31A突变的外源表达GFP-H3.3的细胞则分化受阻（图 5b）。以上结果表明，外源表达H3.3抑制PGs分化可能与AIG序列依赖的蛋白有关。

图 5 H3.3中的A87和G90序列抑制PCs分化的功能

研究人员在检测外源表达H3.3的B细胞中与PCs分化和B细胞相关的基因发现，与PCs分化相关的基因如Prdm1和Xbp1s在外源表达H3.3后被抑制，而B细胞相关的基因如Pax5、Bach2、和Bcl6的表达被上调（图 6a）。由于Irf4和Blimp1对于PCs的分化非常重要，因此在检测IRF4和BLIMP1的蛋白水平实验中发现，外源表达H3.3会降低IRF4和BLIMP1的阳性细胞比例（图 6b, c）；而当IRF4和BLIMP1的蛋白水平被回补时，外源表达H3.3的B细胞能够有效的分化为PCs（图 6d）。上述研究结果表明，在B细胞中外源表达H3.3能够抑制IRF4和BLIMP1的表达，从而影响PCs的分化。

图 6 H3.3调控PCs分化相关基因的表达

研究人员采用GFP的抗体和H3.3的抗体对LPS刺激后的B细胞进行ChIL-seq的检测，结果发现GFP-H3.3的分布与内源性H3.3相似，说明外源性GFP-H3.3与内源性H3.3存在竞争（图 7a）。此外，PCA分析显示，外源表达GFP-H3.3的细胞中的H3.3的沉积的变化更接近于活化的B细胞的染色质重排的变化（图 7b）。这些结果说明PCs的分化需要B细胞基因组中H3.3的移除和特定H3.3的沉积。为了确定H3.3表达对染色质可及性的影响，研究人员对外源表达GFP-H3.3的细胞进行ATAC-Seq实验，在PCA分析中，H3.3的外源表达导致染色质可及性谱从PCs细胞转变为活化的B细胞（图 7c）。B细胞中H3.3的外源表达抑制了随着PC分化而增加的区域，如Xbp1、Prdm1、Sdc1和Jchain的可及性（图 7d）。以上实验结果表明，在PC分化过程中H3.3的异常表达抑制了该过程染色质可及性的变化。

图 7 外源表达H3.3改变染色质可及性

B细胞分化为PCs的过程的分子机制的研究对于我们理解体液免疫应答有重要的作用，文章探究了组蛋白变体H3.3在B细胞分化过程中的对基因组和染色质可及性的调节作用，但这一过程可能也伴随着其他转录因子的调控或表观遗传修饰变化。在文章中发现的H3.3在终末分化细胞中表达下降的现象与我们之前认为的H3.3参与基因激活的作用形成对比，并且文章中观察到的H3.3在活化的B细胞中移除并在PCs分化的基因上沉积，意味着至少H3.3在基因组上的动态变化对于细胞谱系发育是至关重要的。文章虽然没有解释PCs细胞的分化是否一定需要H3.3的下调，但实验结果证明H3.3的下调与PGs的分化密切相关。

H3.3作为需要伴侣蛋白沉积的组蛋白变体，文章中对于伴侣蛋白是否参与B细胞分化到PCs的过程并不清楚，但实验结果证实这一过程与H3.3的AIG序列有关，这也就需要进一步实验来验证伴侣蛋白对于B细胞分化是否存在调控作用。

而外源表达H3.3实验对于PCs的分化抑制可能与改变染色质的可及性有关，外源表达H3.3会抑制与PCs分化相关基因部分的染色质可及性并降低表达，这其实与已有研究相悖，已有研究表明H3.3会增加染色质的开放性。可能的原因是B细胞基因组上原有的H3.3以及染色质可及性的分布并不会受到影响，但外源表达H3.3会抑制PCs相关基因的表达并降低染色质的开放程度，从而影响B细胞的分化；或H3.3的动态变化影响了PCs的分化，但外源表达H3.3对PCs的分化抑制仍然需要深入研究。

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