项目文章Adv Sci (IF14.3) | 脂质体纳米药物Felodipine@LND可改善AD

中山大学附属第三医院胡昔权教授团队在Advanced Science（IF14.3）上发表了题为Blood Brain Barrier-Crossing Delivery of Felodipine Nanodrug Ameliorates Anxiety-Like Behavior and Cognitive Impairment in Alzheimer’s Disease 的文章。AD是最常见的神经退行性疾病，过多的细胞内钙（Ca2+）积累可激活NOD样受体家族、NLRP3，将ER UPR转向促凋亡信号，并促进A𝜷的播散。该研究开发了一种脂质体纳米药物（Felodipine@LND），可通过低强度脉冲超声（LIPUS）辐照辅助穿越血脑屏障（BBB）给药来进行治疗。LIPUS 辅助递送Felodipine@LND有效地将Felodipine@LND输送到患病大脑，从而产生了一系列抗老年痴呆症的积极效果，有望成为一种治疗AD的范例。

旷场实验（open field test，OFT）评估了LIPUS辅助递送Felodipine@LND后对焦虑行为的缓解作用（图1A,B）。接受 PBS 治疗的 5xFAD 小鼠更喜欢靠近墙壁，并在外围停留更多时间，表明它们对焦虑/威胁明显敏感；相反，接受 LIPUS+Felodipine@LND治疗的 5xFAD 小鼠在中心区域花费的时间最多，表明它们的焦虑情绪得到了显著缓解。在新物体识别测试（ORT）中，小鼠会倾向于花更多的时间探索新物体，从而提供它们对熟悉物体有记忆的信息。5xFAD小鼠的辨别指数明显较低，表明它们的记忆较差；然而Felodipine@LND治疗显著提高了5xFAD小鼠的辨别指数（图1C）。水迷宫测试中，与对照组5xFAD小鼠相比，Felodipine@LND治疗小鼠到达平台的潜伏期缩短（图1G）。在探测试验中，与对照组 5xFAD 小鼠相比，Felodipine@LND治疗组小鼠在目标区域花费的时间明显增加（图1G）。总之，这些结果表明，LIPUS 辅助递送Felodipine@LND减轻了AD模型小鼠的焦虑样行为以及空间记忆和表观记忆损伤。

图1 LIPUS+Felodipine@LND治疗可改善焦虑行为和认知障碍

对对照组和LIPUS+Felodipine@LND组小鼠进行转录组分析，LIPUS+Felodipine@LND组中上调基因主要参与regulation of the execution phase of apoptosis、receptors localized to synapse 和positive regulation of endoplasmic reticulum (ER) unfolded protein response (UPR)等生物学过程（图2A）。与对照组相比，LIPUS+Felodipine@LND组小鼠大脑皮质和海马中Perk进一步显著提升，IRE1表达有所增加，而ATF6没有明显变化（图2B-D）。虽然LIPUS+Felodipine@LND激活了Perk信号传导，但并未影响IRE1和ATF6信号传导。

继续分析了对Perk下游信号转导的影响；与对照 5xFAD 组相比，LIPUS+Felodipine@LND组小鼠皮层和海马中 p-eIF2𝛼 的表达显著降低降低，而p-Nrf2 水平进一步升高（图2E-F）；而LIPUS+Felodipine@LND组小鼠的皮层和海马中ATF4 和CHOP的表达显著降低（图2G-H）。TEM 结果显示对照组 5xFAD 小鼠小胶质细胞中 ER 体积扩大，而LIPUS+Felodipine@LND处理改善了 ER 结构的扩张变化（图 2I）。这些结果表明，LIPUS+Felodipine@LND处理促进了Felodipine向大脑的递送，使ER URP中的细胞信号传导从Perk-eIF2𝛼轴转向Perk-Nrf2轴，从而缓解了小鼠的焦虑样行为，并提高了其认知能力（图2J）。

图2 LIPUS+Felodipine@LND使ER URP的信号传导从Perk-eIF2𝛼转向Perk-Nrf2

GO富集分析还显示，LIPUS+Felodipine@LND的下调基因参与calcium-dependent phospholipid binding这一生物学过程（图3A）。钙调蛋白（CALR）与磷脂结合，是免疫细胞的内源性激活剂，参与UPR、细胞凋亡和免疫反应。WB 和免疫荧光结果显示， LIPUS+Felodipine@LND组皮质和海马中 CALR 的相对表达量均显著下降，且荧光强度显著降低；HMGB1 水平也有所下降（图 3B-G）。这结果表明，LIPUS+Felodipine@LND能更有效地抑制CALR的表面转位，并通过减少Perk-eIF2𝛼信号传导来减少小胶质细胞的死亡。

此外，与 5xFAD 对照组相比，LIPUS+Felodipine@LND组的小胶质细胞 Lamp1 阳性囊泡减少，表明其减少了溶酶体的积累；LIPUS+Felodipine@LND组中小胶质细胞周围的 A𝛽 荧光强度也有所下降（图 3H-I），表明其抑制了 A𝛽 斑块的生长。总之，这些结果表明，LIPUS+Felodipine@LND可减少溶酶体的积聚，从而减少5xFAD小鼠脑内A𝛽 斑块的生长（图3J）。

图3 LIPUS+Felodipine@LND可防止ER钙网表面蛋白转运

LIPUS+Felodipine@LND处理降低了大脑皮层小胶质细胞中 NLRP3 的强度（图 4A-B），且能有效抑制NLRP3、phosphorylated NF𝜅B、cleaved caspase-1, ASC、IL-1𝛽 的表达（图 4C-J）。

图4 LIPUS+Felodipine@LND抑制了NLRP3炎症体

将BV2小胶质细胞与oA𝛽共孵育，评估Felodipine@LND的影响（图5A）。经Felodipine@LND处理后，A𝛽 沉积明显减少，CALR 水平显著下降（图 5B-G）。Felodipine@LND处理还降低了oA𝛽诱导的 NLRP3、p-Nf𝜅B 和 ASC 水平（图5H-K），表明Felodipine@LND对NLRP3炎性体活化的减弱作用。

图5 LIPUS+Felodipine@LND可减少体外A𝜷沉积并抑制NLRP3激活

在体外研究了oA𝛽诱导的ER UPR信号传导。Felodipine@LND对eIF2𝛼的磷酸化没有明显影响，但可显著上调Nrf2的磷酸化（图6A-D）；此外，会降低 ATF4 和 CHOP 的表达水平（图 6G,H）。这些结果表明，oA𝛽共孵育增强了小胶质细胞中ER UPR的perk-eIF2𝛼信号转导，从而诱导了CALR的表面转位并激活了NLRP3炎性体。Felodipine@LND抑制了钙网蛋白的移位，并将Perk-eIF2𝛼 转导为Perk-Nrf2信号，从而减轻了小胶质细胞的炎症反应并减少了A𝛽沉积。

图6 LIPUS+Felodipine@LND诱导ER UPR的信号轴转换为Perk-Nrf2

值得注意的是，GSEA分析显示，LIPUS+Felodipine@LND处理引起了inner mitochondrial membrane protein complex 和mitochondrial protein containing complex的上调表达（图7A）。事实上，位于线粒体内膜和外膜的蛋白质与 ER Ca2+ 信号交叉传递，调节线粒体 Ca2+ 的平衡。线粒体 Ca2+ 过载会导致 mtDNA 的胞浆释放，激活 cGAS-Sting 信号，从而推动衰老相关的炎症并导致细胞凋亡。

LIPUS+Felodipine@LND处理后，小鼠的大脑皮层和海马中的 Sting 水平均显著下降（图 7B,C）；且只有在 IPUS+Felodipine@LND组小鼠中才能检测到正在水解的自溶体（图 7D）。CtsD 是降解自噬货物所需的主要溶酶体蛋白酶之一。LIPUS+Felodipine@LND组的 CtsD 表达明显增加，SQSTM1/P62细胞蛋白浓度显著降低，LC3-II:LC3-I 比率更高（图 7F-G）。这些结果表明，LIPUS+Felodipine@LND可通过增强溶酶体酶活性和加速自噬来防止线粒体损伤。

图7 LIPUS+Felodipine@LND增强了线粒体自噬及防止了线粒体损伤

接着评估了 LIPUS+Felodipine@LND 对神经元的影响。LIPUS+Felodipine@LND处理后大脑皮层和海马（如DG 或 CA3）的 Tunel 阳性神经元显著减少，且降低了促凋亡的 caspase 3的表达（图 8A-C）。同时，LIPUS+Felodipine@LND组的神经元数量增加，而皮层和海马的小胶质细胞数量减少，且有明显更多的突触小泡（图 8D-F）。此外，Felodipine@LND组的Syn和SD95表达水平明显增加（图 8G、H）。总之，这些结果表明，LIPUS+Felodipine@LND可防止神经元凋亡、促进突触可塑性并降低小胶质细胞活化。

图8 LIPUS+Felodipine@LND可减少神经元凋亡并促进突触可塑性

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202401731