骨髓单细胞悬液制备

骨髓（Bone Marrow）是一种软组织，位于骨骼内部的空腔，填充在骨髓腔和骨松质间隙中，分为红骨髓和黄骨髓。红骨髓中含有红细胞，呈现为红色，具有造血和免疫作用。黄骨髓主要是脂肪组织，呈现为黄色，无直接造血的功能，但机体贫血较严重时，又可转换为具有造血功能的红骨髓。骨髓中包含造血干细胞、粒细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞等，各种细胞相互协作，维持骨髓功能的正常运转。骨髓如发生异常（如骨髓异常增生或骨髓衰竭），将会严重影响血液系统的健康，甚至危及生命。

（图片来源：https://microbenotes.com/bone-marrow-types-structure-and-functions/）

单细胞测序可以对骨髓进行细胞分类和谱系追踪，帮助研究者理解正常和异常的造血过程，也可以对急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia, AML）、多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)等骨髓疾病进行细胞异质性、骨髓微环境的研究，进而可以进一步识别耐药途径，并寻找新的治疗靶点。因此，对骨髓的研究不仅有助于理解血液疾病的发病机制，也为治疗提供了可能的途径。良好准确的数据结果离不开完善的单细胞样本解离，下面就请跟小编一起，看下吉凯专业团队是如何对骨髓样本进行单细胞悬液制备的吧！

将小鼠骨髓样本分离成单细胞

【其它实验准备】：超净台紫外消毒、备好冰盒冰板，预冷清洗液。

1. 实验准备

样本接收，拍照留存，超净台紫外消毒、备好冰盒冰板，配制含0.5% BSA的 PBS清洗液；

2. 单细胞悬液制备

1) 将样本组织倒入培养皿中，放置在冰板上，记录编号，拍照留存，加入清洗液，用清洗液清洗两次；

2) 弃去清洗液后，剔除骨头上的多余组织，用清洗液清洗3次；

3) 将骨头组织放入皿中，用剪刀将其中小的一头减掉，用1ml注射器吸取清洗液插入骨髓中冲洗，反复冲洗3-4次；

4) 收集冲洗下来的液体，过40um的滤网收集滤液到50ml离心管中，取20ul进行台盼蓝镜检，300g离心5min；

5) 弃去上层液体，加入红细胞裂解液轻柔吹散细胞，静置3min裂红；

6) 加入清洗液终止裂红，300g离心5min，

7) 去上清，加清洗液重悬，镜检、计数，若存在结团，过40um滤器；

8) 取出1E7的细胞量转移到15ml离心管中，加清洗液300g离心5min；重复清洗两次；

9) 弃去上清，加入适量sample buffer重悬混匀，分别取20ul进行AO/PI计数及台盼蓝镜检；根据质检结果选择合适方案，去除杂质及死细胞；

10) 将细胞悬液300g 离心5min；

11) 弃上清，100uL buffer重悬细胞；

12) 涡旋震荡或摇匀Beads（棕色管）30s，加入10uL Beads，吹打混匀；

13) 使用buffer将体积补充至1000 uL，静置1min，将EP管放到磁力架上静止吸附4min；

14) 吸取上清，取20uL计数，加清洗液300g 离心5min；

15) 用sample buffer重悬细胞，分别取20uL进行台盼蓝染色及AOPI计数；

16) 反馈质检结果，等待上机。

小鼠 骨髓

细胞活率：85.29%

活细胞浓度：5.28E+05/ml

大鼠 骨髓

细胞活率：85.41%

活细胞浓度：7.37E+05/ml