微量基因组DNA抽提——为CRISPR文库筛选赋能升级

CRISPR文库筛选技术是基于CRISPR/Cas9系统而开发的一种生物工具，用于高通量基因功能研究。该技术的起源可以追溯到CRISPR/Cas9的发明，这一革命性的基因编辑工具最初用于单基因编辑。随着研究的深入，科学家发现通过整合对应的sgRNA序列可以同时干预或编辑多个基因，CRISPR文库筛选技术应运而生。

通过高通量CRISPR sgRNA文库筛选，实现高通量基因敲除，获得不同基因编辑的细胞，包括功能获得（GOF）和功能丧失（LOF），并探索这些基因的生物学意义。CRISPR文库筛选技术已广泛应用于基因功能、疾病机制、药物靶标识别、肿瘤免疫学等领域，不仅加深了我们对生物过程的理解，也推动了疾病治疗和生物技术的不断突破和创新。

基因组DNA的分离和纯化是CRISPR/Cas9文库筛选的前提，细胞和组织基因组DNA的提取方法如酚氯仿抽提法、异硫氰酸胍法、盐析法、磁珠法等等，每种方法各有优缺点，方法的不同对所提纯的DNA纯度和完整性等有所影响。

吉凯基因采用硅胶柱纯化的方式抽提微量细胞基因组DNA，提取过程中能最大限度的去除RNA、杂蛋白、脂类和其他抑制性杂质，确保得到高纯度的DNA样品，适合后续PCR建库及测序等。

采用硅胶柱纯化的方式，能够大大减少样本起始的用量，比如只需要＜5×10⁶个培养细胞或＜25mg的动物组织，通过硅胶柱纯化方式提基因组DNA之后，可以进行后续建库和测序及生信分析。

吉凯基因提供CRISPR文库的基因组DNA抽提与质检、文库建库与上机测序和数据分析服务。

神经发育障碍（NDD）基因在人类中间神经元发育中的作用。

探究哪些NDD基因干扰皮层中间神经元的发育。

通过类组装体CRISPR筛选技术完成对自闭症谱系障碍与其他神经发育障碍（NDD）中影响皮质中间神经元特定阶段生成和迁移的NDD基因的快速筛选。

构建Dlxi 1/2b::eGFP hiPSC细胞系并将其分化为腹侧前脑类器官（hSO），再将hSO与未标记hiPSC细胞系分化的皮质类器官（hCO）组装成为人前脑组装体（hFA），观察到Dlxi 1/2b::eGFP+细胞迁移至hFA皮层侧，至此构建了皮质中间神经元迁移模型，并通过建立sgRNA文库验证了该平台能够检测早期神经发育阶段的基因。通过FACS分离出单个hSO中Dlxi 1/2b::eGFP hiPSC细胞并评估了每个目标基因sgRNA的相对富集程度。

1. 针对中间神经元生成的筛选发现了13个候选基因，包括CSDE1和SMAD4。

2.确定了33个影响中间神经元迁移的候选基因，包括细胞骨架相关基因和内质网相关基因LNPK。

3. SMAD4和CSDE1敲除会损害大脑皮层下分化。

4. TERF2和LNPK的敲除会损害中间神经元迁移。

5. 核分裂前的内质网移位是人类皮质中间神经元迁移的重要步骤，而LNPK的缺失能够导致中间神经元迁移异常。

这些结果凸显了CRISPR筛选系统地将 NDD 基因映射到人类发育过程，并揭示疾病机制方面的强大功能。