【文库筛选】CRISPR筛选冲高分？临床转化来助力

在初步验证部分候选基因后，作者以细胞周期相关候选基因为切入点深入探究。CCND1、CCND2和CCND3是G1/S期的细胞周期蛋白，它们与CDK4或CDK6相互作用形成活性激酶，通过磷酸化并抑制Rb蛋白促进G1-S期转换。免疫印迹显示ATLL细胞敲除CDK6后，Rb磷酸化水平降低。CDK6敲除特异性抑制ATLL细胞，并且可以被CDK6异位表达回补，CDK4异位表达回补效果较弱。与预期一致，CDK6敲除使得ATLL细胞发生G1期阻滞，此外也能诱导细胞凋亡。敲除CCND2与敲除CDK6产生的表型基本一致。

考虑到CDK6对ATLL的抑制作用，作者进一步挖掘CDK6作为ATLL治疗靶点的潜力。研究表明CDK4/6抑制剂帕博西尼能够抑制多种不同细胞系，并且在ATLL细胞系中使得Rb磷酸化水平降低、发生G1期阻滞以及细胞凋亡。既往研究发现在许多不同肿瘤类型中TP53突变与CDK4/6抑制剂耐受相关，将ATLL细胞系按照TP53的状态分组，发现TP53变异（突变或缺失）的ATLL细胞对帕博西尼更加耐受。APR-246是一种能够使突变的TP53恢复转录激活性质的小分子，TP53突变的ATLL细胞经APR-246处理后对帕博西尼更加敏感，但TP53缺失的细胞没有明细的影响。对ST1细胞进行TP53敲除后，在帕博西尼处理下其生长速度高于TP53野生型的ST1细胞。TP53敲除介导的帕博西尼耐受也体现在细胞增殖、周期和凋亡等表型。TP53能通过诱导p21表达阻止G1/S期转换，p21结合并抑制CDK2/Cyclin E。在ST1细胞中，CDK6的失活或抑制会增加p21和CDK2抑制因子p27的表达，但TP53基因失活的ATLL细胞系中不会出现这一情况，表明帕博西尼对ATLL细胞产生理想的抑制效果可能需要抑制CDK2。确实，对TP53突变的KK1和TP53缺失的Su9T01细胞或敲除TP53的ST1细胞在进一步敲除CDK2后，帕博西尼处理下的生长速度下降。至此，作者揭示了TP53能通过抑制CDK2增强ATLL对帕博西尼的敏感性。

通过对CRISPR筛选结果进行通路分析，发现ATLL细胞依赖mTORC1信号通路。MTOR敲除能够抑制多种ATLL细胞生长，免疫印迹显示ST1细胞中mTOR下游通路分子处于磷酸化状态。鉴于既往研究显示CDK和mTOR抑制剂联合用药对不同类型肿瘤的有益效果，作者利用mTOR抑制剂与帕博西尼处理不同ATLL细胞系，结果显示mTOR抑制剂与帕博西尼可以协同抑制不同TP53状态的ATLL细胞，两抑制剂联合作用对Rb磷酸化水平的抑制效果也高于分别单独用药。

作者进一步对ATLL患者原代细胞进行探究，与细胞系实验结果一致，帕博西尼能够浓度依赖地抑制ATLL原代细胞增殖，在联合mTOR抑制剂后抑制程度增加，而对其他正常的T细胞没有明显影响。为在体内水平探究联合用药的安全性和有效性，作者将ATLL细胞接种至小鼠体内建立异种移植模型并给药，结果显示mTOR抑制剂与帕博西尼分别单独用药时即可抑制移植瘤生长，联合用药后的抑制效果则更加显著，同时药物处理对小鼠体重没有显著影响，证明这一策略的安全性和有效性。