以下文章来源于生物制药小白，作者奥特曼。
概述
本文由诺和诺德公司发表，主要介绍了自有 FGF21 类似物（zalfermin）的开发过程，在本文的引言中较为详细的介绍了现阶段开发的 FGF21 类药物的结构突变意义、半衰期和部分临床药效，如下表所示，非常有借鉴意义；而且还在文章中穿插介绍了FGF21的基本特性，如半衰期，表达、结构等。| 药品 | 突变 | T1/2
| 临床 | 修饰
|
| LY2405319 | Leu118Cys Ala134Cys Ser167Ala His-Pro-Ile-Pro缺失 | / | 降TG 不降BG | / |
| PF-05231023 | des-His Ala129Cys | 短 | 降TG | Fab |
| Pegbelfermin | 108位PEG | 人sc 19-24h | 降肝脏脂肪 | PEG化
|
| Efruxifermin | Leu98Arg Pro171Gly Ala180Glu | 人sc 3-3.5天
| 降纤维化
| Fc |
| Pegozafermin | 172位PEG 175位突变
| 人sc 46-68h
| 降肝脏脂肪 降纤维化程度 | PEG化 |
| BOS-580 | 二硫键 | 每4周给药一次
| 降TG | Fc |
FGF21特征：
1）与肝素结合弱，易进入血液循环；2）KLB 不诱导胞内信号传导，作为锚定位点协助FGF21 和 FGFRs 的相互作用；3）FGF21 的 N 端和 C 端分别是结合 FGFR1c/FGFR3c 和 KLB 的关键；4）FGF21 受体复合物在脂肪组织、肝脏、胰腺和中枢神经系统的特定区域均有表达；5）FGF21 受体复合物在脂肪组织、肝脏、胰腺和中枢神经系统的特定区域均有表达；6）食蟹猴体内，iv 和 sc 给予 FGF21 后系统 T1/2 分别是 2h 和 4.3h ；7）循环内源性人 FGF21 主要在 Pro2 和 Pro4 之后被二肽基肽酶 IV（DPP-IV）和 Pro171 之后被成纤维细胞活化蛋白（FAP）分解， 然而羧基肽酶样蛋白酶活性去除 C 端的 1-3 氨基酸。2）N 端丙氨酸延伸（-1Ala）和 Met168Leu 突变防止氧化的3）N 端丙氨酸延伸（-1Ala）防止 DPP-IV 的降解5）上述修饰不影响 zalfermin 的细胞结合活性
6）在 180 位加入脂肪二酸侧链不会降低 zalfermin 稳定骨架的效力；氨基酸侧链的长度和药效学相关，因此在 180 位上的 C18 二酸侧链可改善小鼠的 PK 和 PD，且在两者之间取得较好的平衡；180 位上的 C18 二酸侧链可阻碍 FAP 对 FGF21 类似物的降解7）FGF21 类似物的免疫原性低，可能是由于 180 位的 C18 二酸侧链8）FGF21 类似物与 FGFR4/KLB 的结合并不伴随受体的活化；与 FGFR2 的结合微不足道
9）FGF21 类似物在多个物种中的体外效力类似且全身半衰期也是延长的，主要存在于血液中10）FGF21类似物在小鼠体内的代谢物水平明显低于 naive FGF21，即经修饰的 FGF21对多种酶稳定11）多维度成药性评估显示，FGF21 类似物可以制备溶液用于皮下注射FGF21 是 2005 年确认的一种潜在的治疗性蛋白质，主要基于其可以促进3T3-L1 脂肪细胞的葡萄糖吸收和减少糖尿病小鼠的血糖。2007 年，FGF21 的抗糖尿病效应在糖尿病猴上确认。FGF21 是一种主要由肝脏分泌的 181 个氨基酸的蛋白质，属于内分泌FGFs 家族（FGF19、FGF21、FGF23）中的 FGF19 亚家族（FGF19）。与旁分泌型 FGF 相比，内分泌型 FGFs 与肝素的结合力较弱，因此可以逃离细胞基质并进入血液循环。FGF21 的信号传导需要 FGFR1c、FGFR2c 或 FGFR3c、跨膜共受体 β-klotho (KLB) 和肝素。KLB 有细胞外结构域、单次跨膜区域、短胞质末尾组成。KLB 并不诱导胞内信号传导，但细胞外结构域作为锚定位点协助FGF21 和 FGFRs 的相互作用。FGF21 的 N 端和 C 端分别是结合 FGFR1c/FGFR3c 和 KLB 的关键。FGF21 受体复合物在脂肪组织、肝脏、胰腺和中枢神经系统的特定区域均有表达。除抗糖尿病作用外，临床前数据表明 FGF21 的药效学剂量可降低胰岛素、甘油三酯、胆固醇、肝脂肪和体重。这使人们对肥胖症、T2D、血脂异常和代谢功能障碍相关性肝炎（MASH）的高效治疗寄予厚望。开发可用于临床的 FGF21 必须解决多种问题，如生产成本、化学稳定性、PK、药效、免疫原性风险和制剂特性。迄今为止，已有七种优化的 FGF21 类似物进入临床试验阶段：LY2405319、PF05231023、BMS-986036（pegbelfermin）、AKR-001（efruxifermin）、BOS-580（前身为LLF580）、BIO89-100（pegzafermin）和 FGF21 类似物 zalfermin（NNC0194-0499）。此外，还有两种 FGF21 受体拮抗抗体也开始临床试验。LY2405319 是第一个接受临床试验的 FGF21 类似物。额外一对二硫键（Leu118Cys 和 Ala134Cys）稳定了这一化合物，并为其开发了一种保留的多用途制剂，用于每日给药一次。缺失四个 N 端氨基酸（His-Pro-Ile-Pro）减轻了因 Pichia pastoris 表达宿主部分清除而导致的化合物质量的不均一性，并进一步消除了该区域的人体代谢的可能。表达期间Ser167Ala 突变阻断了 O 糖基化。在小鼠体内，LY2405319 的效力与 FGF21 相当。然而，在非人灵长类（NHP）体内，与 FGF21（0.03-0.1 和 0.3 毫克/千克）相比，需要更高剂量（3、9 和 50 毫克/千克）的LY2405319 才能降低血糖。LY2405319 在肥胖症和 T2D 患者中进行了测试，经过 4 周的日间治疗后，10 毫克和 20 毫克的两个最高剂量使血浆甘油三酯（TG）降低了 50%，但未观察到降低血糖的效果。在食蟹猴体内，iv 和 sc 给予 FGF21 后系统 T1/2 分别是 2h 和 4.3h ，要达到降血糖的效果，则需要每天一次 sc 给药 FGF212 和 LY240531918 。因此，人们探索了几种 T1/2 的延长策略，如抗体共轭（所谓的CovX-body-format）23、可结晶片段（Fc）融合和聚乙二醇化。第一种增加 T1/2 的方法是 FGF21 类似物 PF-05231023。这种 FGF21 CovX-body结合化合物由两个经过设计的（des-His1，Ala129Cys）FGF21 分子组成，这两个分子通过突变的 Cys 残基与 IgG1 单克隆抗体的抗原结合片段（Fab）共价连接。T2D 受试者静脉单次注射高剂量（200 毫克）PF05231023 后，血浆 TG 在第 4-14 天下降了 40-50%。然而，完整 C 末端和 N 末端的 T1/2 分别为 6.5-7.7 小时和 66.5-96.6 小时，表明 FGF21 C 端区域会快速破坏。通过将 CovX-body Fab 连接到 FGF21 C 末端来防止 C 末端的破坏是不可行的，因为该化合物在体内的效力下降了 200 多倍。Pegbelfermin（BMS-986036）是一种 FGF21 类似物，通过在第 108 位的非天然氨基酸乙酰基苯丙氨酸上连接 30 kDa 的 PEG 分子而延长 T1/2。第 108 位氨基酸的选择是在对潜在修饰位点进行分析之后确定的。在体外和小鼠体内，第 108 位 PEG 化的蛋白被证明可以保持活性，皮下给予大鼠 T1/2 增加了 10 倍以上。与此形成对比的是，人皮下给药的 T1/2 仅为 19-24 小时。在 phase II 的研究中，每天服用一次 10 毫克可使肝脏脂肪含量降低 6.8%，而每周服用一次 20 毫克可使肝脏脂肪含量降低 5.2%。为了准备 phase III ，在两个 phase IIb 的试验（FALCON1 和 2）中，对活检证实患有 MASH 的患者进行了 pegbelfermin 试验，患者每周服用一次 10、20 或 40 毫克化合物或安慰剂。在这些临床研究中，pegfelfermin 未能达到 MASH 缓解和纤维化消退的主要终点。为了了解早期临床候选药物成功的局限性，关注 FGF21是如何代谢的的非常重要。循环内源性人 FGF21 主要在 Pro2 和 Pro4 之后被二肽基肽酶 IV（DPP-IV）和 Pro171 之后被成纤维细胞活化蛋白（FAP）分解， 然而羧基肽酶样蛋白酶活性去除 C 端的 1-3 氨基酸。羧肽酶样蛋白酶的特性尚不清楚。重要的是，只有少数 C 末端氨基酸的缺失会明显降低活性，这有力地表明治疗性 FGF21 类似物应在 C 端保持稳定。这一点对于不经常使用（如每周一次）的类似物尤为重要。Efruxifermin（前身为 Fc-FGF21[RGE]，AMG876）是一种由两个 FGF21 类似物（Leu98Arg、Pro171Gly、Ala180Glu；即 RGE）分子组成的 92kD 化合物，其 N 端与 IgG1 Fc 结构域融合。Pro171Arg 突变可阻止FAP 对 C 末端的降解，延长 efruxifermin 在小鼠体内的半衰期（19h，iv）、食蟹猴体内半衰期（76h，iv）和人体内半衰期（3-3.5天，sc）。Leu98Arg 突变减轻了在高浓度和高温下的聚集倾向。Ala180Glu 突变增加了与小鼠、食蟹猴和人 KLB 的结合，提高了在小鼠PD 模型中的效力，并减少了C-末端区域羧肽酶样的降解。然而，比较 Fc-FGF21(RGE)和 Fc-FGF21(RG) 对食蟹猴代谢参数的影响表明，180E 在非人灵长类体内效力的增加中效果有限。Efruxifermin 已进行多项临床试验。最近，一项第 phase IIb 试验（24 周）显示，每周一次服用 28 毫克和 50 毫克的 Efruxifermin 可使纤维化程度分别降低 39% 和 41%，而安慰剂则降低 20%，有 47% 和 76% 的患者达到了 MASH 缓解，而接受安慰剂治疗的患者中，只有 15% 达到了 MASH 缓解。Pegozafermin (BIO89-100)是一种聚乙二醇化的 FGF21 类似物，皮下给药后可延长糖尿病猴的 T1/2 至 50h， 最近一项 Pegoza-fermin phase1b/2a 研究报告显示，MASH 患者的皮下给药中位 T1/2 是46-68h。Pegozafermin 有一个 N 端蛋氨酸残基延伸，在第 172 位的突变残基的糖基分子上有一个 20kD 的线性 PEG 共价连接，在第 175 位上存在第二个突变残基。在患有 MASH 或 MASH 表型的受试者中，每周一次服用 27 毫克的 Pegozafermin 可使肝脏脂肪减少 70%，这与每周一次服用 50 毫克的 efruxifermin 相当。最近，一项为期 24 周的纤维化 F2/F3 期的 MASH 患者的随机安慰剂对照 phase IIb 试验获得了令人鼓舞的数据，每周一次服用 15 毫克和 30 毫克 pegozafermin 可使 MASH 缓解 37% 和 23%，而安慰剂组则只有 2%；纤维化程度分别降低 22% 和 26%，而安慰剂组只有 7%。BOS-580（原名LLF580）含有两个 FGF21 类似物分子，这两个分子都通过引入二硫键而稳定，并在其 N 端融合人 IgG1 Fc 结构域。据报道，添加二硫键可增加热稳定性，并降低 FGF21 分子的蛋白水解能力。这种 FGF21 类似物已在患有肥胖和高甘油三酯血症的成人中进行试验，每四周注射一次，共给药三次，为期 12 周。结果血浆 TG 下降了 50%，肝脏脂肪含量下降了 60%，这表明 BOS-580 具有每月一次给药的潜力。随着 PK 性能的提高，FGF21 类似物可支持每周或低频次 sc 给药。在临床中，FGF21 类似物的耐受性良好，主要副作用为恶心和腹泻。然而，报道的临床前副作用（下丘脑-垂体-肾上腺轴、血压、骨骼健康和女性不孕）已确认，因此需要进行长期研究来确认长期安全性。虽然各种 FGF21 类似物对血糖和体重的临床疗效令人失望，但对血浆脂质和 MASH 参数却有显著和有意义的影响。Efruxifermin 为确立 FGF21 在 MASH 治疗中的潜在作用铺平了道路，在纤维化评分为 2/3 的 MASH 患者中，仅用了 24周就对 MASH 的缓解和纤维化的改善产生了影响，FGF21 类药物在MASH 这种目前尚无治疗选择的进展性疾病中的应用抱有较高期望。efruxifermin、pegozafermin、BOS-580 和 zalfermin 都在进行 MASH 的 phase II 试验。在此，我们介绍了每周皮下给药一次的 zalfermin（NNC0194-0499，代码：15）的开发情况。与原生 FGF21 相比，zalfermin 具有更好的化学和代谢稳定性、天然的 FGFR 选择性、低免疫原性风险，以及支持长期冷藏储存和常温使用的生物物理和制剂特性。在我们开始研究时，FGF21 C 端区域的 PEG 化、抗体共轭（CovX-body）和 Fc 延长化已在多个病例中被描述过，由于与 KLB 核心受体结合的立体冲突，它们严重影响了生物活性 。为了解决这个问题，我们通过脂质侧链的方式延长了 T1/2，这种侧链可以可逆地与血液中的白蛋白结合。白蛋白粘合剂在 C 端的战略定位提供了完整的生物活性（未与白蛋白结合的 FGF21 类似物部分）以及对蛋白酶活性的保护（通过与白蛋白结合的 FGF21 类似物部分）。为了开发 15，我们首先筛选了 FGF21 内在的成药性限制。蛋白质药物的储存会导致降解，如 Met 的氧化、Asn 和 Gln 的脱酰胺以及 Asp 的异构化，因此，我们对 N 端 Met 延伸的人 FGF21（Met-FGF21，代码：1）和所选类似物在强制降解前后进行了蛋白质化学和生物物理特征进行表征。强制降解的方法是将 Met-FGF21 和所选类似物的液体溶液在不同温度、pH 缓冲液和辅料成分下长时间储存。这些研究帮助我们确定了可以考虑的 15 的骨架突变。我们使用脂质侧链延长体内 T1/2 的策略需要生产半合成的 FGF21 类似物。化学多肽修饰最常用的方法是对 N 端初级氨基或赖氨酸残基的 ε 氨基进行酰化；然而，由于 FGF21 中存在四个赖氨酸残基，因此无法进行特定位点的偶联。相反，我们发现与突变半胱氨酸残基的偶联具有选择性和高效性。为此，我们制备了与白蛋白结合的脂肪二酸侧链，并用溴乙酰胺进行了硫醇烷基化。除了脂肪二酸外，侧链还包含一个 γ-谷氨酸（gGlu）连接子、一个由两个 2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酰基元素（OEG-OEG）组成的亲水间隔物、一个乙二胺（C2DA），最后是一个由溴乙酰基（Ac-Br）衍生的乙酰基，用作半胱氨酸的反应基团。一般来说，我们不能观察到 FGF21 中形成二硫键的两个天然半胱氨酸残基的干扰。一些含半胱氨酸的类似物在筛选生产阶段容易发生降解和二聚化。在许多情况下，对引入的半胱氨酸进行半胱胺保护（见实验部分）解决了这些难题，但仍有一些化合物因不符合筛选阶段的质量标准而被放弃。综上所述，这些发现促使我们首先筛选潜在的侧链修饰位点，然后研究含有各种二酸脂肪酸侧链的化合物。我们筛选了多种侧链，其中一些已在其他文章中提及。FGF21 类似物的体外活性是在稳转人 KLB 受体的 HEK293 细胞中确定的，基于 FGFR 的内源性表达。在这些细胞中，FGF21 类似物诱导 ERK 磷酸化，天然 FGF21 的活性在 1nM 左右。存在 KLB 的条件下，FGF21 结合 FGFR1c （D2/D3）的 Ig 样结合结构域。D2/D3 结构域在小鼠、猪、食蟹猴和人中的序列同源性是＞99%，因此内源性人 FGFRs 用于种属定量实验。相比之下，人 KLB 细胞外结构域的序列同源性从 97%（食蟹猴）到 87%（猪），再到 79%（小鼠）。因此，为了进行物种鉴定，在过表达小鼠、食蟹猴或人 KLB 的 HEK293 细胞中比较了 15 和 Met-FGF21 (1) 的效力。为了补充功能测试，我们利用包含 KLB 和 FGFR1c 胞外结构域的AlphaScreen 技术的结合实验评估所得FGF21类似物。我们预计 C 端脂肪二酸侧链与白蛋白的可逆结合会影响 KLB 的结合，从而影响药效。为了帮助指导侧链分子的选择，我们对选定的 FGF21 类似物在一系列白蛋白浓度下的体外效价进行了测定。使用过表达 FGFR1c/KLB、FGFR2c/KLB、FGFR3c/KLB 和 FGFR4/KLB 的 Ba/F3 细胞，在体外测定 FGF21 工程化对 FGFR 亚型特异性的潜在影响。FGF21 用作参照物，而 FGF1 和 FGF19 则分别作为通过 FGFR2c/KLB 和 FGFR4/KLB 受体复合物信号传导的对照。为了补充这些功能测试，还采用了 FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c 和 FGF4 的胞外结构域与 KLB 结合的方法进行检测。由于内部代谢数据显示 Met-FGF21 在小鼠和迷你猪体内的降解产物相同（图 S1），因此小鼠被选为初步 PK 筛选的主要物种。这与已发表的 FGF21 的 FAP 代谢数据以及 Fc-FGF21 在食蟹猴体内的羧肽酶样降解数据一致。使用抗人 FGF21 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测 FGF21，并通过 LC-MS 进行代谢物鉴定。采用静脉注射和/或 sc 给药法对迷你猪、Landrace-Yorkshire Duroc（LYD）猪和食蟹猴进行了 15 的详细 PK 表征。小鼠体重减轻为鉴别 FGF21 类似物的体内效力提供了一种非侵入性方法。对这些结果的解释应谨慎，因为：(i) 在 FGFR1c 存在的情况下，FGF21 与小鼠的结合力是人类 KLB 的 2-3 倍，因此小鼠的体重减轻可能被高估；(ii) 尽管 FGF21 类似物在小鼠、猪和 NHP 中具有显著的减轻体重效果，但这些结果并不能很好地转化到人。然而，对小鼠体重降低效果好的FGF21 类似物，临床试验中对 MASH 的缓解和纤维化的消退有很大作用。为了评估 15 的体内代谢，我们进行了两组实验。体外实验确定了 15 的 C 端区域在白蛋白存在时是否能防止 FAP 的裂解。此外，通过对 PK 研究血浆样本进行 LC-MS 分析，确定了 15 在小鼠和迷你猪体内的代谢特征。最终的 15 号药物产品的开发工作将在目前的临床试验取得成果后完成。不过，为了给药物产品的开发铺平道路，我们对 sc 注射兼容的液体制剂中 15 的生物物理、化学和制剂特性进行了表征。强制稳定性实验与 Arrhenius 计算相结合，用于说明药物产品的保质期和使用时间。强制降解后的胰蛋白酶肽图和 LC-MS（图 1）显示，在 Met-FGF21（1） 的液体制剂中，Asn121 的脱酰胺作用（+1 Da）与温度有关（37 °C 4 周后超过 30%）。为了缓解这种情况，在 15 中引入了 Asn121Gln 突变，结果证实没有发生脱氨基作用（图 2）。3、防止氧化的 N 端丙氨酸延伸（-1Ala）和 Met168Leu 突变Met-FGF21 (1) 储存在磷酸盐缓冲液中后的胰蛋白酶肽图显示，-1Met 和 Met168 发生了氧化（见图 1，分别为胰蛋白酶肽 T12 和 T1）。我们估计这种氧化发生率为每月百分之几。胰蛋白酶裂解反应本身也会导致氧化，这妨碍了精确定量。为了防止 15 的蛋氨酸氧化，我们在 N 端设计了一个丙氨酸残基来代替蛋氨酸，并将 Met168 突变为亮氨酸。内源性 FGF21 的 N 端（His-Pro-Ile-Pro，HPIP）会被 DPP-IV 裂解，先释放出 His-Pro，随后释放出 Ile-Pro。如果底物的 P1 位上有一个 Pro 或一个 Ala，DPP-IV 会优先裂解 N 端二肽，而 P1′ 位上有一个 Pro 的底物通常对 DPP-IV 的水解具有抗性。重组大肠杆菌表达的人 FGF21 增加了一个 N 端残基，该残基将一个 Pro 带入 P1′ 位。我们想确认在FGF21 中 -1Ala 的设计是否能提供 DPP-IV 蛋白酶解的保护作用。因此，我们使用 LC-MS 来监测体外 DPP-IV 对 1-31（存在于内源性 FGF21 中）和-1-31(-1Ala) 两种截短肽的降解情况（无实验）。1-31 的半衰期是 41 分钟，而-1-31 在被 DPP-IV 降解后仍稳定（表1）。1-31 被DPP-IV 分解，并鉴定出两种代谢物，它们分别代表了先由 His-Pro 丢失和随后的 Ile-Pro 丢失形成的 3-31 和 5-31 产物（图S2）。FGF21 含有 11 个天冬氨酸残基，这些残基有可能发生异构化。L-天冬氨酸异构化是一种常见的现象，导致产生三种产物：D-天冬氨酸、L-异天冬氨酸和 D-异天冬氨酸。Asp102、Asp38、Asp25 和 Asp5 主要异构化成它们的 L-异天冬氨酸形式的，且以温度相关的方式进行。该异构化是通过胰蛋白酶肽图联合 LC-MS（图 2 和 SH）进行表征的，并根据肽图的紫外信号和阿伦尼乌斯计算（5、25、30 和 37°C）对降解产物进行了定量。异构化速度随温度升高而加快；因此，Asp102 在 30°C 下 1 个月后异构化达到 1.0%，但在 4°C 下 2 年后异构化仅为 0.1%（根据阿伦尼乌斯计算推断）。无论水平多低，其他异构体（D-异天冬氨酸和 D-天冬氨酸）都被鉴定出来。根据结构模型推测，Asp102 位于延伸环中，而该环FGF-受体复合物的相互作用非常重要（数据未显示），因此，阻止异构化的突变通常会导致 FGF21 活性的丧失，并经常导致 FGF21 受体选择性的改变（数据未显示）。因此，我们保留了天然 Asp 残基。总的来说，通过引入-1Ala 延长、Asn121Gln 和 Met168Leu 突变，实现了 15 骨架的稳定。这些突变具有很好的耐受性，并且只对活性产生了微小的影响，这一点在将 15 的稳定骨架（4）与 1 在 HEK293-/KLB 表达的细胞中进行比较（2.0 vs 1.6nM）（表 2 和表S 1）得到了证明。与 1 相比，4 出现对 FGFR1c/KLB 小但重要的结合亲和力丢失（pIC50 6.18 ± 0.10 vs 6.56 ± 0.89，p=0.017；图3 和表 S2）。7、FGF21 C 末端的脂肪二酸修饰没有导致生物活性的丢失在FGF21 C端区域使用脂肪二酸修饰的策略旨在减轻FAP和羧肽酶样的降解，并通过可逆白蛋白结合延长T1/2。要做到这一点，必须不影响FGF21类似物游离部分（非白蛋白结合部分）的生物活性。表 2 和表 S1总结了我们对4骨架 C 端区域的修饰位点扫描结果。第167、170、171、172或180位的半胱胺保护（用于连接脂肪二酸侧链的突变半胱氨酸残基）对FGF21的效力影响甚微。相反，176、178、179或181位的半胱胺保护则会使药效降低至少10倍。与稳定骨架（4）（39 vs 2.0 nM，表 2）相比，181（18）位的脂肪二酸修饰明显降低了药效。相比之下，在 180 位带有脂肪二酸侧链的化合物15的效力与稳定骨架（4）相似（3.3对2.0nM，表2）。在AlphaScreen结合试验中，181位（18）修饰后药效减弱，而180位（15）修饰后药效保持不变，18的结合显著弱于稳定的骨架（4）（pIC50 5.72 ± 0.02 vs 6.18 ± 0.10，18 VS 4，p = 0.01，图 3 和表 S2），但15的结合力与4相似（pIC50 6.13 ± 0.80 vs 6.18 ± 0.10，图 3 和表 S2）。根据这些数据，我们推断在 180 位加入脂肪二酸侧链的耐受性很好，不会进一步降低稳定骨架的效力。这清楚地将 15 与其他在最外层C端序列中含有t 1/2 延伸分子的 FGF21 类似物区分开来。因此，在 FGF21 Tyr179 上进行线性20kDa PEG化以及将抗体偶联到FGF21 Ser181Lys 突变残基（CovX-body 分子格式）上都会导致体外效价下降100倍以上，而重组 Fc 延长FGF21 C端也会导致 KLB 结合力显著降低和体外活性丧失。虽然15（17）中 Ser181 的缺失略微降低了 FGFR1c/KLB的结合力（pIC50 5.79 ± 0.05 vs 6.13 ± 0.08，p = 0.04，图 3 和表 S2），但这并没有转化为功能测试中的效力损失（表2）。这些结果与之前报道的从FGF21中移除Ser181 的轻微但依赖于测定的影响一致，并支持了我们保留 Ser181 的决定。这些发现为我们提供了在 180 位或离 C 端更远的位置进行修饰的选择，就像在 172 位进行 20 kDa PEG化的 pegozafermin 一样。虽然 180 位的脂肪二酸侧链可消除因 C 端发生羧肽酶样裂解而导致药效降低的风险，但如果修饰位点离 C 端太远，则会降低或取消这种保护作用。结构模型预测白蛋白会与 180 位上的脂肪二酸侧链结合，以消除 Pro171 之后 FAP 裂解的可能性（图 4）。这些考虑因素促使我们将 180 位作为首选修饰位点。8、180C 位上的 C18 二酸侧链可改善小鼠的 PK 和 PD脂肪二酸侧链的长度与白蛋白结合亲和力呈正相关。考虑到在 FGF21 的 C 末端共价连接 Fc，抗体或 PEG 可显著降低活性，我们预测在非共价白蛋白结合期间效力丢失。为了确定脂肪二酸侧链和白蛋白亲和力都支持其 T1/2 的延伸和生物活性，我们研究了侧链长度是如何影响药物的活性和 PK 及 PD 性能的（表 3）。在不存在HSA 的情况下，在 180 位（15、20、21、22 和 23）携带 C12-C20 侧链的化合物的效力与最稳定的骨架（4）相似。对于携带 C16、C18 或 C20 侧链的类似物（表 3）观察到体外活性中 HSA 浓度依赖的降低，但对于携带较短（C12 或 C14）或不携带侧链的类似物，则未观察到 HSA 浓度依赖性下降，这表明只有较长的侧链结合一定程度的白蛋白，从而影响了 FGF21 受体的活化。这些数据表明，当与白蛋白结合时，15 可能通过立体效应阻止与 KLB 结合，从而抑制了其受体的活化（表 3、图 4C 和图 S3）。与这些发现一致的是，长侧链需要在体内延长其半衰期。因此，C16、C18 和 C20 二酸侧链类似物 iv 给予小鼠中显示系统 T1/2 增加了 3.2、12.6 和 23.6H（表 3）。随着 FGF21 类似物侧链长度（C12-C18）的增加，瘦小鼠的体重减轻幅度也增加，其中含有 C18 侧链的 15 （每天 1 毫克/千克，治疗 6 天后体重减轻 2.6 g）的效果最好。头对头比较显示，与 C20 侧链相比，C18 侧链在饮食诱导的肥胖小鼠中优势更明显。经过 10 天的治疗（每天 0.3 毫克/千克，每天给药一次）后，15 和 23 使体重分别减轻了 9.8 克和 7.0 克（p< 0.001）（表 3 和图 S5 和图 S6）。另外，15 减少 DIO 小鼠的体重是以剂量依赖的方式（图 S5和图 S6）总之，C18 脂肪二酸侧链 (15) 优越的 PD 效应是通过优化白蛋白结合引起的半衰期延长和自由 15 之间的平衡得到保证的，因此是全面激活的 FGF21 类似物部分。短脂肪二酸侧链提供次优的半衰期延长方案，而 C20 侧链因结合白蛋白太紧密阻止了生物功能的优化。利用可逆的白蛋白结合来确保较长的循环 t1/2（即非活化的结合部分）和较高的体内生物活性（即游离的活性部分）的概念已得到充分证实。内源性人 FGF21 在 Pro171 位被 FAP 裂解。鉴于 15 的 C18 脂肪二酸与天然 FAP 裂解位点接近，我们研究了 15 在体外对 FAP 裂解的敏感性（图 5）。不存在脂肪二酸侧链中，将 Met-FGF21 纳入来确定FAP的裂解情况。我们将化合物 5 作为比较物，因为它与 15 的不同之处在于其侧链位于 71 号位，而 71 号位与 15 的侧链的位置相距甚远（见图 4B）。在没有白蛋白存在的情况下，1/15/5 的半衰期类似，大约在27-57分钟。LC-MS 确认，在 Pro171 和 Ser172 位因为蛋白酶解各化合物的浓度都出现了下降。白蛋白的存在明显增加了 15 对 FAP 降解的稳定性（达 448 分钟），而白蛋白对 1 和 5 的 T1/2 几乎没有影响。因此，在白蛋白存在的情况下，15 对 FAP 降解的保护作用可归因于 180 位侧链的位置。180 位修饰所产生的立体阻碍（未在 71 位发生修饰），与 15 的结构模型和其与白蛋白的相互作用一致。这表明，当 15 在 FAP 的活性位点上与白蛋白结合时，无法获得 15 骨架中的裂解识别序列。10、15 的模型及与白蛋白结合、FAP 降解和修饰位置有关的结构方面图 4A 显示了 FGF21 类似物 15（20.3 kDa）的氨基酸序列和脂肪二酸侧链。在 AlphaFold 中生成了 15 的结构模型（不含脂肪二元酸侧链），表明 FGF21 类似物 C 末端具有多个扩展位点，这与该区域具有高灵活度相关。图 4B 中显示了 15 的典型 AlphaFold 模型。白蛋白与 somapacitan （PDB 6QIO）复合物的晶体结构用于解释，15 与白蛋白结合状态下（调节连接子的长度用来匹配 15），15 和白蛋白之间的距离和大小的关系。15 可能和白蛋白的其他位点结合。图 4B 还显示了 FAP 酶（PDB 1Z68），并标出了催化隧道中的关键氨基酸残基。三个分子按比例绘制。白蛋白与 180 位的脂肪二酸侧链结合，会立体阻碍 FAP 进入 Pro171/Ser172 裂解位点（存在于内源性 FGF21 中），并阻止 KLB 结合，从而导致效力丧失（表 3）。FGF21 C 端区域类似物的结构-活性关系（表 2）与 FGF21 和 KLB 之间的相互作用一致（图 4C）。因此，预测保留效力的类似物在结构上是允许的（在 167、168、170-172 和 180 位设计），而显示效力丧失的类似物（176-179 和 181 位）在结构上是不利的。综上所述，结构方面的考虑支持 15 具有保留活性和白蛋白介导的防止 C 端降解的作用。鉴于与内源性 FGF21 存在组叉反应的免疫原性风险，降低免疫原性和开发抗药抗体 (ADA) 对 FGF21 类似物非常重要。阐明肽与人类白细胞抗原（HLA）II 类结合的关键过程是开发 ADA 的必要步骤，为了解决这一关键过程，我们按照之前的描述进行了硅预测分析。以人类 FGF21 为参考序列，对 15 的氨基酸序列进行了分析，以寻找潜在的 T 细胞新表位。没有预测到新表位，表明其免疫原性较低。除此之外，脂肪二酸的修饰可能减少其他肽的免疫原性风险。在临床设定中，其他 FGF21 类似物可诱导低滴度非中和 ADAs ，对 15 进行进一步对的临床表征有助于解释其免疫原性风险。在过表达 KLB 以及 FGFR1c、R2c、R3c 或 R4 的 Ba/F3 细胞中，发现化合物 15 对 FGF 受体的选择性与 Met-FGF21 (1) 类似（表 4）。从表 4 和图 S4 中可以看出，15 和 Met-FGF21 (1) 在激活 FGFR1c/KLB 和 FGFR3c/KLB 受体复合物方面具有同等效力。MetFGF21 (1) 和 15 不能激活 FGFR2c/KLB 或 FGFR4/KLB 复合物。FGFR4/KLB 的结果与之前的数据一致。FGF21 是否激活 FGFR2c/KLB 的观察结果截然不同。在转染的 L6 细胞中观察到 FGFR2c/KLB 激活，而 Suzuki 等人使用与我们类似的 Ba/F3 细胞系统时未观察到激活。各研究组之间有关 FGFR2c/KLB 参与的结果差异可能与所采用的检测方法（L6 与 Ba/F3）的细胞背景有关。然而，在我们的 AlphaScreen 结合试验中，我们无法在 FGF21、FGFR2c 和 KLB 之间建立结合信号，这支持了 FGF21 与 FGFR2 的结合微不足道的观点。15 和 1 在不同 FGF 受体亚型之间的结合显示，15 的受体选择性与 1 在 FGFR1c、FGFR3c 和 FGFR4 与 KLB 复合物之间的选择性相同（图 6）。值得注意的是，与 FGFR4/KLB 的结合并不伴随受体的活化（表 4、图 6 和 S4），这与之前发表的文章一致。以前的研究表明，人 FGF21 与小鼠 FGF21-受体复合物的结合和激活效力高于人 FGF21-受体复合物。为了测试 15 工程化蛋白是否会改变不同物种之间的效力，从而最终影响疗效，我们在体外比较了其对小鼠、猴和人的效力。在过表达猴或人 KLB 的 HEK293 细胞中，15 和 Met-FGF21 的效果相当（表 5），而在过表达小鼠 KLB 的细胞中，15 的效果略强于 Met-FGF21。在过表达小鼠 KLB 的细胞中，15 和 Met-FGF21 激活 ERK 信号磷酸化的效力比表达人 KLB 的细胞高出约 10 倍，而在过表达猴 KLB 的细胞中，这两种化合物的效力比表达人 KLB 的细胞略高。虽然应谨慎解释不同细胞系之间的效力差异，但人 FGF21 对小鼠 KLB 的效力更高，这与之前的研究一致。在 HEK293/KLB 细胞中，15 和 Met-FGF21 的效力也相当（表 4），而人 FGFR1c/KLB 结合数据显示，15 的 IC 50 与 1 相比有小幅但显著的增加（图 3 和 6，以及表 S2）。综上所述，我们认为 15 和 Met-FGF21 在不同物种中的体外效力相当。在小鼠体内 15 的延长全身半衰期，在迷你猪、LYD猪和猴体内（表 6）也得到了证实。食蟹猴体内，15 的 iv 半衰期为 53h，Met-FGF21 的半衰期为2h，支持在人体内每周给药一次。目前另外两种临床候选药物在食蟹猴体内的半衰期的进行了报道，因此，经静脉注射的 efruxifermin 和经皮下注射的 pegozafermin 在食蟹猴体内的半衰期分别为 76 小时和 50 小时 。15 FGF21 类似物在不同物种中的分布容积（Vd）较低，表明 15 主要存在于血浆中。此外，在 LYD 猪（54%）和食蟹猴（92%）中观察到了 15 可接受的且临床相关的绝对 sc 生物利用度。总体而言，FGF21 15 的 PK 表征与其他 C18 脂肪二酸 T1/2 延长类似物的 PK 表征一致，其中包括每周一次的 semaglutide ，该肽在小型猪体内的 T1/2 为 46h，Vd 值分别为 0.1019 L/kg。在小鼠体内，FGF21 可穿过血脑屏障，它在小鼠大脑中的作用对 FGF21 的代谢作用非常重要。虽然 FGF21 在大脑中的激动作用对药理学读数的决定因素、调节和影响仍有待了解，但目前临床候选药物中使用的不同 t 1/2 延伸策略（脂肪酸、PEG 化、Fc 融合）可能会被证明能区分它们进入大脑的途径和在大脑中的作用。通过对 PK 研究血浆样本进行 LC-MS 分析，研究了 15 在小鼠和迷你猪体内的代谢情况。模拟物 5 被用来确定非工程化 FGF21 C 末端区域在小鼠体内的降解情况；此外，还研究了 Met-FGF21 (1) 在小鼠和迷你猪体内的代谢情况（表 S5、图 S7 和图 S1）。在小鼠血浆样本中，通过 LC-MS 进行完整质量分析并结合 MS/MS 测序，确定了 5 的主要 -1-171 代谢物（FAP 裂解产物）（图 7 和表 S6 和图 S8）。此外，还鉴定出了 5 的多种含量较低的代谢物，包括-1-151、-1-167 和三种可能的羧肽酶样产物：-1-180、-1-179 和-1-178。其中一些代谢物在图 7 所示的保留时间窗口内。在小鼠（iv）体内，15（12 小时，表 6）的 t 1/2 时间比 5（3 小时）长 4 倍。这种差异是由于 15 的蛋白水解稳定性造成的，因为 15 的代谢物水平比 5 低得多（见图 7 中的 FAP 代谢物）。15 中含量最高的代谢物是 152-181（根据 AUC 计算，其暴露量为 15 的 2%，见图 8），由残基 Gly151 和 Ile152 之间的裂解产生。此外，-1-180 和 172-181 代谢物的含量也较低。15 在迷你猪体内的代谢概况与在小鼠体内的代谢概况相似（表 S5 和图 S7）。在 Met-FGF21 (1) 的迷你猪和小鼠 PK (iv) 血浆样本中 ，我们观察到了 C 末端羧肽酶样裂解和 FAP 裂解（表 S5 和图 S7），与小鼠中 5 的数据相似。我们解决 C 端代谢问题的方法与 Fc-FGF21(RGE)类似物的方法不同，后者含有两个 C 末端点突变 Pro171Gly 和 Ala180Glu。这种化合物后来被命名为 efruxifermin，它也显示出在小鼠、食蟹猴和人体内的 T1/2 增加。总之，15 的高代谢稳定性可归因于 N 端 Ala-1 的伸长防止了 DPP-IV 的裂解，180 位的 C18 脂肪二酸侧链防止了 FAP 的裂解和羧肽酶样活性。我们对 15 的生物物理特性进行了研究，以确定是否有可能制成用于 sc 注射的液体制剂。考虑到 15 具有酸性等电点，我们选择了磷酸盐缓冲液来控制 pH 值，该缓冲液呈弱碱性且在很大程度上与温度无关。15 的结构模型表明存在连续的疏水性斑块。为了在疏水表面和极性溶剂之间提供两亲界面，选择了甘油作为张力调节剂。发现 15 的溶解度在 pH 值低于 6 时非常有限，而在 pH 值≥ 6.5 时则完全可溶（图 9）。在观察到沉淀区之前，溶解度曲线受 pH 值依赖性聚集的调节。动态光散射（DLS）测定的平均流体力学半径（Rh ）表明了这一点。虽然 pH ≥ 7.5 时，Rh 只有 3.1 nm，但在 pH 值为 7.0 时，Rh 明显增加，而在 pH 值为 6.5 时，增加更为明显。研究了 pH 值对胶体稳定性的影响。扩散相互作用参数 kD 是用 DLS 确定的（图10）。在 pH 为 7.0 的时候，kD 是阴性的（-32g/mL）,在 pH 值为 8.2 时，kD 为正值。这表明 pH 为 8.2 时，分子间的排斥力占主要作用，因此预计胶体稳定性会增强。热稳定性是通过差示扫描量热法（DSC）测定的。如胶体稳定性所示，热转变中点温度（Tm）随 pH 值的增加而升高，pH 值为 8.2 时的 T m 最高（图 11）。此外，Tm 随蛋白质浓度的增加而增加（图中未显示）。这些结果与 FGF21 的研究结果非常吻合，后者在 ∼1.5 mg/mL 时 DSC 为50℃，在 0.2 mg/mL 时圆二色谱（CD）显示为 62 °C。在 LY2405319 中，通过引入额外的二硫桥增强了热稳定性。最近的研究表明，FGF21 的热解构是完全可逆。综上所述，我们认为 15 的热稳定性适合制药用途。总之，pH 值是 15 的生物物理特性的主要调节因素。溶解度、胶体稳定性和热稳定性都随着 pH 值的升高而增加，pH 值为 8.2 时最适合液体制剂。与 FGF21 一样，15 的自结合（二聚体或更大的低聚物等非共价团聚）也与浓度有关。15 浓度为 49 至 88 mg/mL 的 10 mM 磷酸盐（pH 值为 8.2，含 2% 甘油）样品注入非对称流场流分馏多角度光散射（AF4-MALS）系统。如 AF4-MALS 分馏图（图 12）所示，二聚体和较大低聚物的含量随着浓度的增加而增加。稀释到 5 mg/ mL 后（使用 10 mM 磷酸盐，pH 8.2，2% 甘油缓冲液），再次用 AF4-MALS 对样品进行分析，结果表明自结合是可逆的。表 7 列出了静态储存 15（15 毫克/毫升）的加速稳定性读数。选择该浓度是为了支持计划中的一期临床研究。在 4 °C 下观察到的降解极少，表明长期冷藏储存是可行的。在 30 °C 下，观察到低水平降解，15 的 L-isoaspartate102 形式是主要降解产物（每月形成 0.9%），支持在室温下储存。我们在此介绍了用于每周一次 sc 给药的长效 FGF21 类似物 zalfermin（15）的开发过程。C 末端区域的脂肪酸二酸修饰实现了多个重要目标，包括：(i) 通过白蛋白结合延长 T1/2；(ii) 防止 FAP 介导的 C 末端失活降解；(iii) 强效激活 FGF 受体复合物。zalfermin 的这些特点使其在体内具有很高的生物效力。我们通过筛选侧链修饰位点和脂肪二酸侧链，工程化了 zalfermin 的 C 末端区域。脂肪二酸侧链在 C 末端区域的确切位置以及侧链与白蛋白结合的强度是一个特殊的设计挑战。因此，需要仔细选择修饰位点，以避免因 KLB 结合力被破坏而导致药效急剧下降。过强的白蛋白结合力会限制生物功效，因为它会使 FGF21 类似物的白蛋白结合状态比例过高，无法与 KLB 结合。因此，C 末端的设计是一项平衡工作，最终通过在 180 位的半胱氨酸上连接 C18 脂肪二酸侧链解决了这一问题。这些化合物的活性和对 FAP 裂解的保护作用与 FGF21 类似物、FGF 受体、KLB、白蛋白和 FAP 之间相互作用的结构模型十分吻合。此外，Zalfermin 的 N 端延长了一个丙氨酸残基，可防止 DPP-IV 降解；Asn121Gln 突变可防止脱氨基；Met168Leu 突变可防止氧化。Zalfermin 具有与人类 FGF21 相似的 FGF 受体选择性，预计免疫原性较低。在小鼠、食蟹猴和人中，受体复合物活化的转化都得到了证实。zalfermin 的液体制剂可长期冷藏储存，在使用中可在环境温度下储存一个月，并可进行sc注射。关于安全性、PK 和疗效的 1 期临床研究（NCT03015207、NCT04722653 和 NCT03479892）支持 zalfermin 的进一步发展，目前该药正处于治疗 MASH 的 2b 期临床研究（NCT05016882）。1、Development of Zalfermin, a Long-Acting Proteolytically Stabilized FGF21 Analog
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2026-03-09
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