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Cell：张锋团队揭示首个真核基因编辑系统Fanzor的结构多样性和DNA切割机制

生辉

2024/08/29

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DNA切割基因编辑系统

2023 年 6 月 28 日，张锋团队（Makoto Saito 和徐沛雨为论文共同第一作者）在 Nature 期刊发表论文【1】，在真核生物中发现了第一个 RNA 引导的 DNA 切割酶——Fanzor，更重要的是，这种新型 CRISPR 样系统，在真核生物中广泛存在，且具有独特的基因编辑潜力，可以在重编程后实现对人类基因组的编辑。相比 CRISPR-Cas 系统，Fanzor 系统非常紧凑，更容易递送到细胞和组织中。而且，Fanzor 系统没有旁系切割活性，可实现更精准的基因组编辑。

2024 年 8 月 28 日，张锋团队（徐沛雨和 Makoto Saito 为论文共同第一作者）在 Cell 期刊发表了题为：Structural Insights into the Diversity and DNA Cleavage Mechanism of Fanzor的研究论文【2】。该研究展示了 Fanzor 蛋白在不同生物中所表现出的分子多样性，并深入解析了其通过 RNA 引导的 DNA 切割机制，为进一步的基因工程改造和开发奠定了基础。

2021 年 9 月，张锋团队在 Science 期刊发表论文【3】，发现了一类广泛的转座子编码的 RNA 引导核酸酶，并将其命名为 OMEGA 系统（包括IscB、IsrB、Tnp8），它是 CRISPR-Cas 系统的祖先。

而 Fanzor 是一种由转座子编码的真核 TnpB-IS200/IS605 样蛋白，来自真核生物的 Fanzor 蛋白与来自原核生物的 Tnp8 具有远程同源性。对 Fanzor 蛋白的生化表征表明，Fanzor 是一类 DNA 切割内切酶，使用 ωRNA 来靶向基因组中的特定位点。这是首次在包括动物在内的真核生物中发现这种机制。

张锋团队发现，Fanzor 系统可以在人类细胞的目标基因组位点上产生 DNA 插入和缺失，但其最初在剪切 DNA 方面的效率低于 CRISPR-Cas 系统，通过系统工程改造，张锋团队在 Fanzor 蛋白中引入了一系列突变，可使其活性提高 10 倍。此外，张锋团队还发现，与一些 CRISPR 系统和 OMEGA 系统中的 TnpB 不同，真菌来源的 Fanzor 蛋白没有表现出旁系切隔活性（Collateral Activity），也就是说，Fanzor 不会在 RNA 引导下切割目标位点附近的 DNA，这意味着，Fanzor 可能实现比 CRISPR-Cas 系统更精准的基因组编辑。

在这项发表于 Cell 期刊的最新研究中，张锋团队通过冷冻电镜解析了来自不同物种的 Fanzor 蛋白以及不同构象下的 13 个结构，包括来自藻类 Guillardia theta 的 GtFz1、真菌 Spizellomyces punctatus 的 SpuFz1 和寄生真菌 Parasitella parasitica 的 PpFz1。

这些结构揭示了 Fanzor 蛋白在 RNA 结合、DNA 识别和切割中的独特性。例如，该研究发现，尽管这些蛋白在 RNA 结合界面上表现出保守性，但在 DNA 靶向临近基序（Target-adjacent Motif，TAM）的识别和负责切割的催化位点上存在差异，尤其是 GtFz1 的催化三联体中出现了非典型的 N 残基，这一变化增强了其体外 DNA 切割活性。此外，PpFz1 中的一个独特结构域被发现能够与一种称为亲环蛋白（Cyclophilin）的蛋白质结合，提示其可能在寄主生物的生理功能中扮演重要角色。这一发现揭示了 Fanzor 蛋白在基因转移和寄生关系中的潜在功能。

此外，该研究通过解析不同 DNA 结合构象的结构，揭示了 Fanzor 如何调控自身以激活 DNA 切割活性。在 GtFz1 中，未结合 DNA 的状态以及两个结合了不同形式 DNA 的结构展示了 REC 结构域在 R-loop 形成和稳定中的关键构象变化。而在 SpuFz1 和 PpFz1 中，研究解析了具有不同数量 Guide/DNA 碱基配对的结构，揭示了 RuvC 结构域中的一个环状结构（通常被称为“Lid”）对蛋白激活的关键调控作用。该研究还发现，这个 Lid 能够随着 Guide/DNA 配对碱基的数量发生构象变化，从而调控蛋白的激活。通过对同源蛋白家族的模型分析，研究团队还发现这个 Lid 区域在所有 Cas12、TnpB 和 Fanzor 家族蛋白中都可能存在构象适应性，暗示了一种广泛存在的 RNA 引导核酸内切酶活性的激活机制。