良渚实验室孔娜团队公开一项吸入式IL-10 mRNA阳离子聚合物纳米制剂专利

肺部炎症性疾病是一类常见的感染性疾病，主要表现为终末端气道、肺泡和肺间质的炎症，其中以细菌性肺炎最为常见，占比80％左右。当前临床上针对重症肺炎的药物治疗主要包括抗生素、激素和免疫球蛋白。虽然这些药物在一定程度上控制了肺炎的进程，但仍然需要开发更加高效安全的策略或药物来治疗肺部炎症。

白介素-10（IL-10）是一种关键的免疫调节性细胞因子，对免疫系统的平衡和控制具有至关重要的作用。IL-10既可以通过抑制促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）的产生来减少炎症反应；也可以直接作用于多种免疫细胞，包括巨噬细胞和T细胞，通过减少其抗原呈递能力、以及活化和增殖，来减少免疫反应。IL-10的这些生理作用使得其在炎症性疾病的控制方面展示出巨大的应用潜力。

最近，mRNA技术在抵御全球新型冠状病毒大流行方面发挥了重要作用。这项技术的核心是将编码目标蛋白的mRNA分子递送到人体细胞内，然后利用细胞自身的分子机器来翻译这些mRNA分子，产生相应的蛋白质。相比于经典的直接蛋白补充疗法具有多种优势，其中最重要的是，mRNA技术可以使目标蛋白在人体细胞内自然产生，这意味着所产生的蛋白质能够以其生理状态出现，包括正确的折叠和后期修饰(如糖基化)，这将使其更好地发挥生理作用。此外，mRNA技术的高效性也使得其在药物设计、成本控制方面表现出优势。然而，目前白介素-10以及mRNA技术在肺部炎症性疾病治疗领域的应用鲜有报道。

2024年9月27日，良渚实验室孔娜、肖凡和陈义全公开了一项“一种吸入式IL-10 mRNA纳米制剂及其制备方法和应用”发明专利【公开(公告)号:CN118697901A】[1]。本发明首次设计吸入式的IL-10 mRNA纳米制剂，能够有效保护和稳定mRNA，避免雾化剪切力对mRNA的影响，从而可通过肺部吸入式给药，有效治疗肺部炎症性疾病。

研究团队采用了脂质-聚合物杂化递送系统（lipid-polymerhybridnanoparticles，LPNPs）作为mRNA递送载体。将通过聚酰胺-胺PAMAM和1,2-环氧十四烷加成反应获得的阳离子脂质G0-C14和mRNA按1:12.5的质量比混合形成G0-C14/mRNA络合物，随后依次向其中添加PLGA、DMG-PEG2k，各组分质量比为mRNA:G0-C14:PLGA:DMG-PEG2k＝1:12.5:12.5:50。将上述混合液快速注射到5倍体积的柠檬酸缓冲液（pH＝4.0，10mM）中，然后对PBS进行透析，除去有机溶剂和恢复体系pH值，最后超滤浓缩得到IL-10 mRNA LPNPs纳米制剂，使其中mRNA浓度为50μg/mL。

G0-C14是一种阳离子类脂化合物烷基修饰聚氨基胺（PAMAM）树枝状大分子，可用于制备一系列巨噬细胞靶向纳米颗粒（NPs）（图1）。

哈佛医学院施进军教授团队在一行研究中构建了由G0-C14和mPEG-PLGA共聚物组成的新聚合纳米颗粒，在体内递送表达PTEN蛋白的mRNA，有效逆转肿瘤免疫抑制微环境，提高肿瘤细胞对PD-1单抗的响应和药物抗肿瘤免疫治疗效果[2]。

图1. G0-C14结构

动态光散射（DLS）表征所得IL-10 mRNA LPNPs的水合粒径在170 nm左右，经过肺部定量雾化给药器的雾化剪切力后，其尺寸变化不大，表面电位也变化不大（图2,3）。此外，TEM表征显示，雾化前后IL-10mRNA LPNPs的形貌几乎没有变化，表明IL-10 mRNA LPNPs具有良好的胶体稳定性，能抵抗雾化剪切力的影响。

图2. IL-10mRNA LPNP经雾化剪切力后的粒径变化

图3. IL-10mRNA LPNP经雾化剪切力后的表面电位变化

考虑到PLGA的难溶性特点，其不易被常用的表面活性剂Triton-100溶解而释放出mRNA。因此，为了更准确测定IL-10 mRNA的包封率，采用凝胶电泳法来测定IL-mRNA的包封率，通过mRNA的凝胶成像灰度值进行定量。IL-10 mRNA的包封率高达90％以上，多分布在92％～97％之间。

通过肺部定量雾化器向Balb/c小鼠给药脂多糖（LPS）建立小鼠急性肺部炎症。分别设置3个实验组（n=3）：PBS组、空的纳米载体组（Blank LPNPs）、IL-10 mRNA LPNPs组，每两天给药一次，共给药5次。给药结束后对小鼠安乐死，取肺组织进行H&E染色观察肺部组织形态，并进行IL-10的免疫组化染色。收集血清，并对血清中的IL-6、TNF-α等炎症因子进行测定。

组织切片显示，肺部吸入IL-10mRNA LPNPs可以显著缓解肺泡壁的增厚和致密，组织显现出丰富的IL-10表达（图4）。

图4. 肺部吸入不同样品后的组织切片H&E染色

通过测量血液中的炎症因子来整体评估IL-10对小鼠炎症的抑制作用，IL-10 mRNA LPNPs处理的小鼠的TNF-α和IL-6明显得到抑制（图5）。经过5次肺部给药后，小鼠的体重没有明显变化，证明了肺部吸入IL-10 mRNA LPNPs良好的生物安全性。

图5. 吸入治疗后血清炎症因子含量

本发明首次设计了吸入式的IL-10 mRNA纳米制剂，基于阳离子脂质G0-C14的脂质-聚合物杂化递送系统LPNPs能够有效保护和稳定mRNA，避免雾化剪切力对mRNA的影响，有效用于肺部吸入式给药。小鼠体内给药实验表明，IL-10 mRNA LPNPs可以有效治疗肺部炎症性疾病，显著缓解肺泡壁的增厚和致密，抑制验证因子TNF-α和IL-6的表达，为治疗肺部炎症性疾病提供了一种新方法、新思路。