【on-target】AAV感染骨骼 | 血清型·启动子·注射用量 | 一篇就GO了！

骨骼（Bone）是脊椎动物的支架，其基本结构由骨组织、骨膜和骨髓等组成。骨组织又分为密质骨（Compact bone）和松质骨（Cancellous bone），密质骨坚硬且承受压力，松质骨则轻而富有弹性；骨膜（Periosteum）包裹在骨的表面，含有血管和神经，起到营养供给和感觉的作用；骨髓（Bone marrow）内含大量血细胞，有造血功能。除此之外，关节和软骨也是非常重要的结构。关节（Arthrosis）是骨与骨之间的连接，将动物的骨骼系统连接成一个功能整体；软骨（Cartilage）则是一种有弹性且光滑的结缔组织，在四足动物中通常以关节软骨的形式覆盖和保护关节处长骨的末端。骨骼不仅提供身体支撑和形状，还保护关键器官，允许运动和协调。此外，骨骼储存矿物质（如钙和磷），并通过骨髓产生血细胞，参与代谢过程。因此，健康的骨骼对于脊椎动物的生存和活动至关重要。

长骨结构示意图（From Wikipedia）

当免疫系统错误地攻击关节内的组织，会导致关节发热、肿胀和疼痛，这类自身免疫性疾病被称为类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis, RA）。骨质疏松症（Osteoporosis）是一种全身性骨骼疾病，其特征是骨量低，骨组织微结构破坏，导致骨骼疏松，增加骨折风险。而骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种高度流行的退行性关节疾病，由于关节软骨和下层骨骼损坏，引起慢性疼痛、僵硬，甚至身体残疾。以上疾病都是目前骨骼方向的研究热点。

骨关节炎的症状（PMID: 36737426）

在这些研究中，重组腺相关病毒（recombinant Adeno-associated virus, rAAV）作为基因递送工具被广泛应用。rAAV具有血清型多样性、低免疫原性和长期稳定表达基因的特点，是理想的基因治疗载体。在骨骼中，rAAV可以通过传递基因来调节不同骨骼细胞的功能，改善骨关节炎等疾病的病理状态，为骨骼相关疾病的治疗提供新的策略。

AAV由于其衣壳蛋白的差异，血清型种类繁多。不同血清型的AAV具有不同的组织亲嗜性。AAV9、AAV-DSS、AAV8具有在体内转导骨的能力；AAV2和AAV8可以介导基因递送至软骨、滑膜；而AAV9和AAV5可以用于感染骨髓间充质干细胞。

关节内注射AAV9高效感染骨组织（PMID: 31273195）

静脉注射AAV-DSS感染股骨（PMID: 31273195）

骨骼中有多种不同类型的细胞，其中研究最多的包括骨原细胞、成骨细胞、骨细胞和破骨细胞等。骨原细胞（Osteogenic cell）是骨组织中的干细胞，在骨的生长发育、改建、骨组织修复过程中可分裂增殖并分化为成骨细胞。成骨细胞（Osteoblast）由骨原细胞分化而来，能够分泌胶原蛋白，形成有机基质；随后骨基质矿化，成骨细胞成为骨细胞。骨细胞（Osteocyte）来源于成骨细胞，占总骨细胞的 90%~95%。破骨细胞（Osteoclast）可释放多种蛋白酶、碳酸酐酶和乳酸等，溶解骨组织。除此之外，软骨细胞和髓系细胞也受到越来越多的关注。

骨骼细胞类型（From Wikipedia）

为了实现在特定细胞中选择性表达目的基因，需要根据细胞类型不同来选择合适的启动子。COL1A1编码I型胶原蛋白的pro-alpha1链，COL1A1启动子是较为常用的成骨细胞和成纤维细胞特异性启动子；而COL2A1编码II型胶原蛋白的alpha-1链，COL2A1启动子可以特异性靶向软骨细胞。Runx2是RUNX转录因子家族的成员，在成骨细胞分化、成熟和骨形成中起着不可或缺的作用，因此Runx2启动子可特异性靶向早期成骨细胞。骨钙素（Osteocalcin，OC）是骨骼中表达的主要非胶原骨基质蛋白，OC启动子表达于成骨细胞、骨细胞、肥大软骨细胞中。CD11b是白细胞表面的整合素分子，可作为骨髓成熟髓系细胞的标志物。

靶向骨骼细胞的启动子推荐

在AAV介导的骨骼基因递送中，最常用到的注射方式是关节内注射、骨髓内注射和静脉注射。具体的注射方式和注射剂量参考下表。

骨髓内注射示意图：ac胫骨内注射，bd髂骨内注射（PMID: 34112243）

04

客户应用案例

骨质疏松症是全球范围内与骨代谢相关的主要全身性疾病之一。STARD3NL与骨质疏松症相关特征密切相关，然而其在成骨细胞中的分子功能机制仍不清楚。复旦大学的马端团队发现低骨量患者和卵巢切除（OVX）诱导的骨质疏松症小鼠的骨组织中STARD3NL表达水平较高。机制研究表明Stard3nl与Anxa2结合能够抑制 β‐catenin表达，从而抑制Wnt信号传导和下游成骨分化。此外，AAV9介导的Stard3nl沉默通过注射到膝关节中逆转了OVX诱发的骨质疏松小鼠的骨质流失。此研究中用到的AAV产品由和元生物构建。

AAV9介导的Stard3nl沉默可预防OVX诱发的骨质疏松症中的骨质流失（PMID: 35098646）

类风湿性关节炎的特征是免疫稳态失衡。p53是已知的关键肿瘤抑制基因，同时也在炎症和免疫反应中发挥关键作用，负责多种细胞因子和基质金属蛋白酶（MMP）的表达。前期研究在RA患者中发现了p53突变，澳门科技大学的Vincent Kam Wai Wong团队试图研究p53在RA发病机制中的作用。研究人员利用和元生物提供的AAV产品来建立p53WT/R211*佐剂诱导性关节炎（AIA）大鼠模型，再通过微型CT分析等各种参数评估大鼠的关节炎状况。机制研究结果表明，p53R213*/R211*与TBK1相互作用并抑制IRF3-STING级联，说明TBK1是潜在的抗炎靶点。

单次膝关节内注射AAV-p53R211*对AIA大鼠模型的抑制作用（PMID: 37935918）

肥胖引起的慢性炎症会加剧多种器官组织退化和干细胞功能障碍，然而对骨骼组织的影响和潜在机制仍不清楚。中南大学湘雅医院的李长俊团队发现肥胖会触发巨噬细胞分泌的细胞外囊泡的microRNA谱的变化，导致骨骼干细胞/祖细胞（SSPC）分化为成骨细胞和脂肪细胞，并导致骨质恶化。筛选发现miR-140（具有促进脂肪生成的功能）和miR-378a（具有增强成骨的功能）通过靶向Pparα-Abca1轴协同决定SSPC成骨和脂肪生成分化的命运。实验过程中，研究人员利用和元生物构建的AAV产品在肥胖小鼠体内过表达miR-378a，结果表明 miR-378a 治疗减轻了肥胖小鼠的骨质恶化。

过表达miR-378a能够治疗肥胖引起骨质疏松（PMID: 39072285）

参考文献