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吉玛AAV研究指南-胰腺篇

吉玛基因

2024/12/09

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胰腺篇吉玛 AAV

一、胰腺和AAV简介

胰腺是一个狭长的腺体，横置于腹后壁1~2腰椎体平面，质地柔软，呈灰红色。胰可分胰头，胰体，胰尾三部分。胰腺分为外分泌部和内分泌部两部分。外分泌腺由腺泡和腺管组成，腺泡分泌胰液，腺管是胰液排出的通道。内分泌腺由大小不同的细胞团——胰岛所组成，胰岛主要由4种细胞组成：α细胞、β细胞、D细胞、PP细胞。

胰腺相关的病症如糖尿病已成为世界范围内的主要健康问题，而胰腺癌的死亡率排在所有恶性肿瘤的首位，5年总生存率仅为6%。因此，胰腺研究对医学发展是非常重要的。

组织特异性启动子AAV用来追踪特定的胰腺细胞类型是研究糖尿病，胰腺炎和胰腺癌的非常强大的工具。本文将详细介绍胰腺研究中AAV的推荐使用方法，包括血清型和启动子的选择，以及胰腺导管内注射方法。

二、血清型推荐

已有的研究表明AAV6、AAV8、AAV9对胰腺具有较好的感染能力，其中AAV8应用最为广泛。AAV8、AAV9对胰腺整体感染效果较好，而AAV6对胰腺导管细胞、腺泡细胞感染效率较高，且肝嗜性弱于AAV9 [1, 2]。详见下表1，图1汇总信息。

表1. AAV胰腺导管内注射转导效率对比

【注】胰腺导管内注射体重为 20-30g小鼠，AAV滴度为10^12 GC/mL，给药剂量为150μL/只，注射速率为6μL/min。数据统计来自每组5只小鼠的量化结果。

图1. AAV6和AAV9对于胰腺和肝脏的感染特异性对比[1]

三、启动子推荐

胰腺的细胞构成复杂，借助特异性启动子可以帮助研究人员实现目的基因在不同目的细胞中的表达。在研究中可以选择广谱性启动子如CMV、U6等，也可以选择相应的组织特异性启动子以获得最佳表达效果，例如对于胰岛β细胞可选择PDX1、Insulin2（Ins2）启动子，在胰岛α细胞中可选择GCG作为特异性启动子，对于胰腺导管细胞可选择Sox9启动子，在转基因小鼠中也常应用Pdx1启动子在胰腺中实现基因特异性表达。

下表2为AAV靶向胰腺的组织特异性启动子：

表2. 胰腺研究常用组织特异性启动子

四。注射方法选择

胰腺研究中常用的给药方式包括系统注射（静脉注射、腹腔注射）和胰腺导管内注射。系统注射操作简单，无需复杂的手术操作，对实验动物的侵入性小，但对胰腺侵染效率较低，小鼠注射剂量一般较大，根据文献推荐为1~5*10^12 VG/只；胰腺导管内注射具有一定技术难度，但在组织特异性和感染效率上比系统给药更高，所需病毒量也较少，通常小鼠注射剂量在1~5*10^11 VG/只。[1]

3.1 系统注射[1]

图2. 尾静脉注射AAV侵染胰腺[1]

如图所示，每只小鼠尾静脉注射1~5*10^12 VG 的AAV8或AAV9 病毒。启动子为EF1a，报告基因为eGFP（A/B）；尾静脉注射1*10^12 VG/只小鼠的剂量条件下，腺泡细胞的转导效率AAV9高于AAV8（C）；当尾静脉注射AAV9剂量达到5*10^12 VG/只小鼠，eGFP+ 腺泡细胞可以达到45%（D）。

3.2胰腺导管内注射[2]

以小鼠为例（详见图3），具体操作步骤如下：

（一）麻醉● 1分钟

1) 用2-2.5%（重量/体积）异氟烷通过吸入麻醉小鼠。在手术过程中，应根据小鼠的呼吸和心率密切调整吸入量。典型的输液手术需要30-40分钟，尽量避免手术中不必要的延误。

2) 将小鼠放在37°C已被消毒的加热垫上。使用胶带将小鼠固定在手术操作台上，并剔除下胸和腹部的毛发。用浸有70%乙醇纱布消毒无毛的手术区域。

（二）剖腹手术●1分钟

用剪刀在腹部中线切开皮肤。接下来，沿着白线切割腹部肌肉，形成1.5厘米中上腹的手术切口。剖腹手术时避免损伤任何潜在器官。

（三）暴露胰管●0.5分钟

使用棉签轻轻拉出胃部。旋转并拉伸十二指肠，露出胆胰管及其与十二指肠的连接处（Oddi括约肌），看起来很苍白（图3c）。胃、十二指肠和胰腺应主要用棉签处理，避免使用钢制器械挤压，可以大大减少组织创伤、水肿和出血，这对于小鼠术后恢复至关重要。如果手术进行得当，胰腺炎将极为罕见。除了棉签，还可以使用精心处理的钢制手术器械，如环形钳，来操纵十二指肠，而不会造成组织损伤。手术过程中注意避免十二指肠过度扩张引起损伤，甚至可能扭曲胆胰管。腹腔外的肠道应覆盖湿润的纱布（含温的生理盐水），以避免大量热量损失和组织干燥。

（四）胰腺导管插管● 0.5-3分钟

1) 稍微向后旋转十二指肠，露出远端胆胰管。从十二指肠后侧和胰腺十二指肠部分看，乳头区域也应可见（图3c）。手术暴露充分至关重要，因为需要将微型钳精确地放置在上方的胆总管上胰管的分支点，以防止输注到肝脏中。

2) 为防止肝脏灌注，在胰管分支上方的胆管上放置一个微型钳。当放置第一个微型钳时（图3c），应避免夹紧位于胆总管正下方的门静脉。

3) 使用30号针在Oddi括约肌对面开一个小孔，距离Vater壶腹1-2mm。接下来，将一根31号钝端套管穿过由30号针在十二指肠壁上形成的小孔，然后穿过Oddi括约肌（图3d）。导管尖端应位于胆胰管中胰管分支的起始处（图3e）。如果解剖结构不清楚，可以将导管尖端放置在Oddi括约肌的正上方。插管是方案中最重要、最困难的部分，需要稳定的手法小心操纵。钝端导管有助于降低导管损坏的风险。

4) 在Oddi括约肌处用另一个微型夹子夹住导管周围的乳头，以防止病毒输注过程中回流或泄漏（图3f）。微夹钳压力应调至较低，避免损伤十二指肠。导管的后端连接到微型输注装置。

（五）输液●25-30分钟

打开注射泵，按照表3中列出的流速注入预定量的AAV病毒溶液。

表3. 胰腺导管内注射方案参考（剂量、体积、流速等）

（六）拔出套管和微型夹具● 0.5分钟

输注完成后，取下Oddi括约肌上的微型钳，轻轻将导管从胰管中拔出。接下来，移除胆胰管上的微型钳。

（七）缝合●2分钟

1) 输注后，用6-0缝合线闭合导管在十二指肠上形成的孔。这种缝合线一般不会影响实验结果，也不会影响小鼠的存活。

2) 将肠道放回腹部，用4-0缝合线用活针缝合腹部肌肉。

（八）术后护理●10分钟

将小鼠放回配备加热垫（37°C）上的笼子里，直到它完全恢复。术后连续3天皮下注射酮洛芬（Sigma，目录号K1751），剂量为5mg/kg，每日一次，用于镇痛。

图3. 胰腺导管内注射图示[2]

（a）胰腺导管注射示意图。（b）设备组装效果图。（c）在肝脏附近的胆管上放置一个微型钳，以防止肝脏灌注。（d）使用30号针在Oddi括约肌对面打一个小十二指肠孔。接下来，将一根31号钝端导管通过十二指肠Oddi括约肌小心地放置在胆胰管中。（e）导管尖端应位于胆胰管中胰腺分支的起始处。（f）然后，导管可以用第二个微型钳固定在Oddi 括约肌处，以防止病毒液回流到十二指肠。黄色箭头指向胆胰管，绿色箭头指向胰胆管中的导管尖端，蓝色箭头指向Oddi括约肌，红色箭头指向胰胆管中的胰腺导管分支。

图4. 胰腺导管内注射结果代表图像。[2]

AAV8-CMV-GFP输注1周后的胰腺荧光图像（b）和免疫荧光图像（c）。I，肠；INS，胰岛素染色（红色）；S、脾脏。标尺，50µm。

本文介绍的几种常用的胰腺感染AAV的选择方案和注射方法。胰腺研究中，根据文献和以往经验，血清型AAV8应用最为广泛；AAV8、AAV9对胰腺整体感染效果较好；AAV6对胰腺导管细胞感染效果较好。启动子选择常规启动子CMV、U6以外，也可以根据需求选择组织特异性启动子如mPDX1，Ins2等。尾静脉注射和腹腔注射可以感染胰腺，但是效率很低，注射剂量大；而胰腺导管内注射的感染效率最高，但对手术技术有更高要求。

五、参考文献

[1] Quirin KA, et al. Safety and Efficacy of AAV Retrograde Pancreatic Ductal Gene Delivery in Normal and Pancreatic Cancer Mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Sep 30;8:8-20. doi: 10.1016/j.omtm.2017.09.006.

[2] Xiao X, et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 2014 Dec;9(12):2719-24. doi: 10.1038/nprot.2014.183.