人参皂苷Rg3诱导人肝癌细胞凋亡作用的研究

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细胞培养及处理

实验分为5组：人参皂苷Rg3高剂量组(80μg/ml)、中剂量组(40μg/ml)、低剂量组(20μg/ml)及阳性对照组(顺铂，80μg/ml)和空白对照组(PBS，pH7.4)。细胞培养16h后，弃去培养液，在培养板孔内加入不同剂量的人参皂苷Rg3溶液、空白对照液PBS和阳性顺铂对照液(DDP，80μg/ml)。培养24h后，更换处理液。于培养期间定时观察细胞的生长情况并记录。分别于12h、24h、48h、72h收集细胞样品。实验设平行孔，并重复3次。计算肿瘤抑制率=(对照组吸光值-处理组吸光值)/对照组吸光值*100%。

MMT法测定细胞增殖和生长

在96孔培养板的细胞中，加入四甲基偶氮唑盐(MTT)20μl/孔(终浓度为5mg/ml)、于37℃中继续孵育4h。弃去孔内液体，加人DMSO100μl/孔，充分混匀，置微型振荡器上振荡5~10min，至普通光学显微镜下兰色晶体产物完全溶解，于酶标仪上测样品570nm波长处的吸光值。

细胞凋亡的电镜分析

于加药后的不同时间，收集培养于6孔板上的细胞，用25g/L戊二醛和10g/L四氧化锇进行固定，梯度乙醇脱水，树脂渗透包埋后进行常规超薄切片制备、染色，并在透射电镜下观察细胞凋亡的形态学变化特点。

统计学分析

采用SPSS10.0统计软件，计量资料数据X平均±S来表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

人参皂苷Rg3对细胞生长影响的形态学分析

细胞培养72h后，在普通光学显微镜下分析人参皂苷Rg3组、顺铂组和PBS组细胞的形态学变化，见图1。结果表明：PBS对照组的细胞贴壁生长良好，边界清楚，细胞呈菱形，人参皂苷Rg3组可见细胞变圆变小，有许多细胞碎片。随Rg3给药剂量增加，活细胞逐渐减少，顺铂组细胞也可见大量细胞死亡碎片。人参皂苷Rg3作用12h、24h、48h后，未见细胞形态的明显变化。

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人参皂苷Rg3对细胞生长的抑制作用

根据MMT法测定细胞培养后各实验组在570nm波长处的吸光值，分析人参皂苷Rg3对细胞生长的抑制作用，见表1。高、中、低剂量组细胞生长的抑制率分别为34.6%、19.1%、6.1%，抑制作用呈剂量依赖性，与空白对照组的细胞生长抑制率(5.7%)相比，以人参皂苷Rg3高剂量组于作用72h后对细胞生长的抑制作用最明显(P<0.001)，中剂量组次之(P<0.05)，低剂量组及Rg312h、24h、48h组未见明显差别。阳性对照顺铂组的细胞生长抑制率为22.2%。

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人参皂苷Rg3诱导细胞凋亡的电镜分析

电镜下观察人参皂苷Rg3诱导细胞凋亡作用。凋亡细胞判定为细胞核或细胞质呈致密团块，有明显的核质固缩及边聚等凋亡形态特征。与PBS组比较，高剂量组发生凋亡的细胞数多。顺铂组细胞水肿、坏死程度明显。

本实验中，用人参皂苷Rg3高剂组和中剂量组作用肝癌细胞72 h后，细胞生长受到抑制；电镜分析发现细胞发生典型的细胞凋亡的形态结构改变。本实验为在临床上应用人参皂苷Rg3治疗肝癌提供一定的实验依据，并且为临床合理使用人参皂苷Rg3奠定了理论基础。

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