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HPLC:“三板斧”在低限度杂质方法开发中的应用

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药事纵横
HPLC
759
9个月前


背景:


1.HPLC对杂质限度较低的方法开发思路主要是提高与浓度相关参数(杂质响应一前提下):如杂质的浓度、进样体积等,但当改变这些条件无法达到要求时只能寻求其他高灵敏(MS)的检测器,但是开发一个质谱的方法比较有难度,且不容易普及。

2.峰高和峰面积是HPLC中最为常见的两个重要参数:峰高越高,代表着化合物有更好的信噪比;峰面积越大,在进行定量限重复性研究时会越简单。

3.超高效液相色谱的原理主要是针对谱带的展宽进行了优化:柱外管路进行改进(0.1mm内径);色谱柱进行改进(多数将内径改为2.1mm,1.9um小颗粒)。

4.目前HPLC主要使用的色谱柱内径是4.6mm,如4.6*150mm;4.6*250mm规格等类型,相比较UPLC化合物峰的展宽会比较大,但是如果UPLC色谱柱在普通液相使用,一般仪器的压力又无法耐受。

图1


过程:


1.第一板斧:采用中间内径(3mm)色谱柱,提高杂质峰高,缩短运行时间

问题:方法开发时,使用YMC Triart C18(4.6×50mm,5μm)色谱柱,流速0.8ml/min,流动相 0.1%磷酸溶液-[四氢呋喃:乙腈(1:2)](10:90),发现杂质的响应较低,灵敏度不够,见图1-A;

解决方法:根据UPLC提高柱效的理论,我们采用了内径小一个规格的色谱柱YMC Triart C18(3.0×100mm,3μm),其他条件不变;测定见图1-B。

结果:杂质峰高提高了近一倍,而且缩短了保留时间,提高了分析效率。

2.第二板斧:降低流速提高杂质的峰面积

问题:经摸索发现更换高效的色谱柱后只提高杂质峰高,峰面积的响应没有变化(因杂质峰面积较小时重复性不好,定量限不好做);同时该色谱柱内径较小,导致柱压过高,有超压风险。

解决方法:根据紫外检测器(浓度型检测器)峰面积与流速的乘积为一常数这一理论,将流速降为0.6ml/min。

结果:杂质峰面积得到提高,满足了定量需求;同时也将降低了柱压,进一步提升了小内径色谱柱在普通液相中的应用。

3.第三板斧:提高有机相比例,调整保留时间,进一步提高峰高。

问题:流速降低虽提高峰面积,但导致杂质保留时间延后。

解决方法:提高有机相比例为92%。

结果:经调整流速和有机相比例后色谱图见图1-C,杂质保留时间在和图1-B一致的情况下,峰高和峰面积都得到了提高;同时也将降低了柱压。


结论:


采用更换3.0mm内径色谱柱+降低流速+提高有机相比例三板斧思路将杂质的峰高可以提高1-2倍,峰面积也得到增大(根据流速调整大小而改变),同时将分析时间缩短。

该思路在杂质方法开发时运用较为简单,只有三板斧,试下就知道效果怎么样,可以应用在液体制剂的迁移物方法开发、化合物的限度较低的方法开发,对于清洁验证方法开发也比较实用。



<END>
*声明:本文由入驻药融云的相关人员撰写或转载,观点仅代表作者本人,不代表药融云的立场。
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