龙传生物人源化PNPLA3 I148M转基因小鼠模型，助力国内蓝海非酒精性脂肪性肝病小核酸药物研发

龙传生物

2024/07/25

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酒精肝硬化 nonalcoholic fatty l

(1) 非酒精性脂肪性肝病的新药开发是一片蓝海市场

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）系指可以从简单的脂肪肝（脂肪变性）进展成非酒精性脂肪肝炎（NASH）、进展成肝纤维化（liver fibrosis）、肝硬化（肝脏之不可逆的晚期结瘢）、肝衰竭（liver failure），甚至肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）等终末期广系列的肝脏疾病^[1]，所有NAFLD阶段具有共同点为在肝脏细胞脂肪的累积和浸润。其中NASH是NAFLD中较为严重的一种，表现为5%以上的肝细胞脂肪变合并小叶内炎症和肝细胞气球样变性，伴或不伴肝纤维化。

NAFLD是西方国家最常见的肝病形式，在美国进行的大约10% 的肝移植是针对与 NAFLD 相关的肝硬化^[2]。发展中国家包括我国，在生活水平提升饮食结构改变的同时，多因素造成的代谢紊乱疾病NAFLD在我国成年人中患病率高达29.2%，较过去10年整体增长10%。目前NAFLD的全球发病率约25%^[3]，预计到 2030年，全球将有4.9亿NAFLD患者，全球NAFLD药物市场将增长至322亿美元^[4]。FDA暂未批准任何NAFLD新药，新药开发是一片蓝海市场，然而构建合适于NAFLD新药药效评价的动物模型，是新药研发的基石。

(2) PNPLA3 I148M是被公开认可NAFLD患者基因诊断标志

NAFLD被定义为由酒精摄入以外的原因引起的肝脏脂肪堆积过多超过5%，具有很强的遗传成分，Patatin样磷脂酶域蛋白3（PNPLA3）的遗传变异赋予对脂肪肝疾病的易感性。研究人员对多种族人群进行了全基因组关联扫描，鉴定了PNPLA3的I148M点突变与肝脏脂肪水平升高和肝脏炎症密切相关，且该变异在西班牙裔中最常见，PNPLA3 I148M纯合子患者的肝脏脂肪含量高>2倍^[5]；基因诊断含有PNPLA3 I148M标志的人群，整体NAFLD发病率高达30%-50%，且该突变携带人群就占肝硬化患者的11%。在中国汉族人群中，早在十年前已通过超声确定PNPLA3 I148M 遗传变异在中国人群中与NAFLD病患的脂肪变性程度相关^[6-7]。

PNPLA3 148M致病NAFLD的机理是，PNPLA3蛋白对甘油三酯（triglyceride ，TG）和视黄酯（retinyl ester）具有水解酶活性，促进肝细胞和肝星状细胞中的脂滴重塑（lipid droplet remodeling），然而PNPLA3 148M突变蛋白的酶活性降低，肝脏积累过量的TG，造成脂肪性肝炎和肝纤维化，最终进展到肝衰竭和肝细胞癌^[8-9]。

(3) PNPLA3 是治疗NAFLD小核酸药物的热门靶点已进入I/II期临床研究

Arrowhead/杨森、阿斯利康/Ionis、礼来、再生元和Alnylam等公司，开发了靶向PNPLA3 治疗NAFLD的小核酸药物研发管线。其中已进入I/II期临床研究为代表的Arrowhead 公司，2023年2月公开了基于TRIM™平台，开发了靶向PNPLA3的siRNA原研药物ARO-PNPLA3^[10]（原名JNJ-75220795开发自强生旗下杨森公司）的I/II期临床研究（NCT04844450），皮下注射112名具有某些NAFLD遗传倾向和在筛查时确定存在肝脏脂肪变的受试者，ARO-PNPLA3在I148M突变的纯合子患者中，最多抑制肝脏脂肪达40%且呈剂量依赖性；PNPLA3 是治疗NAFLD小核酸药物的热门靶点。

(4) 现有的人源化PNPLA3 I148M转基因小鼠模型

目前国内可取得最优的人源化PNPLA3 I148M稳转基因小鼠模型^[11]，具备了人源PNPLA3编码区（CDS）和3’UTR非编码区，此模型充分考虑到已上市siRNA小核酸药物成药序列多为3’UTR。然而本模型的限制在于，并非肝脏组织特异性的模型，人源化的PNPLA3 I148M基因，除了在肝脏表达，尚在肾脏、副睾脂肪、皮下脂肪等脏器组织非特异性表达；且该模型病无NAFLD具备的脂肪性肝炎病理、高血脂生化检验值等指标被公开。

Arrowhead公司开发的用以治疗NAFLD，靶向PNPLA3的siRNA原研药物ARO-PNPLA3，以分泌型人胎盘硷性磷酸酶（SEAP）报导基因，构建了人源化PNPLA3-SEAP瞬转小鼠模型，通过Phospha-Light^™SEAP报告基因检测试剂盒检测小鼠血清，进行ARO-PNPLA3候选药物的药效评价，但含有人源PNPLA3 CDS和3’UTR非编码区的模型表达不稳定，最终截短人源PNPLA3 cDNA^[9]，故此瞬转模型无法同时表达人源PNPLA3 CDS和3’UTR序列。

Alnylam 公司在专利中揭露其靶向PNPLA3小核酸药物的小鼠体内药效评价使用了使用AAV8-hPNPLA3小鼠模型（图4），这是一种瞬转小鼠模型，通过腺相关病毒AAV8包裹GLuc荧光报导基因和人源PNPLA3基因，于建模后14天进行药效评价^[12-13]。通过三质粒共转染进行AAV8病毒包装人源PNPLA3基因，收集细胞液后再通过超高速离心收集纯化和浓缩病毒，根据国家卫生健康委员会制定的人间传染的病原微生物目录^[14]，AAV感染动物实验应于动物生物安全二级实验室（ABSL-2）操作。

然而，上述的人源化PNPLA3 I148M转基因小鼠模型皆未展示NAFLD重要的脂肪性肝炎病理、高血脂生化检验值等指标。瑞典哥德堡大学和阿斯利康/Ionis合作以PNPLA3 I148M 基因敲入NAFLD小鼠^[8]，体内验证靶向PNPLA3 ASO小核酸药物国外的药效评价，然而这是鼠源而非人源化小鼠模型。PNPLA3 I148M 基因敲入NAFLD小鼠，使用同源重组在小鼠基因组导入鼠源PNPLA3 I148M点突变，并使用高脂饮食鼠源PNPLA3 I148M雄鼠26周，肝脏显著表达肝细胞脂肪变和肝细胞气球样变性的病理，肝脏和血清皆表达较高的TG值；使用高蔗糖饮食喂食鼠源PNPLA3 I148M雌鼠15周，血清表达了较高的TG值。虽非人源化模型，但展示了NAFLD重要指标。

(5) 龙传生物的人源化PNPLA3 I148M转基因NAFLD小鼠模型的数据展示

①小动物活体成像实时侦测Luc2表达

对7周龄小鼠瞬转基因后，使用45%高脂饲料日粮型（Rodent diet with 45% calories from fat）饲育8周。饲料成份除了43.5% 的维持基础饲料以外，较常规添加了17.5% 猪油、12% 蔗糖、10% 全脂奶粉、13% 酪蛋白、2% 磷酸氢钙等，高脂饲料一直持续到实验终点15至16周龄时。瞬转核酸结合了45%高脂饲料诱导的造模方式，为以获得既是人源化PNPLA3 I148M CDS和3’UTR转基因，又是非酒精性脂肪性肝病疾病的复杂小鼠模型。

高脂饲料饲养8周后，小动物活体成像仪拍摄前一晚，将小鼠禁食不禁水过夜。将小鼠麻醉，胸腔剃毛后，体重若为25g的小鼠，每只腹腔注射250 μl 的D-荧光素钾溶液，依序胸部朝上的仰卧姿势，放置在有气体麻醉罩的小动物活体成像仪上，以生物发光模式撷取Luc2讯号。如图5所示，成功将Luc2蛋白特异性表达在小鼠肝脏上，其讯号肉眼可见呈现剂量依赖，亦即Luc2讯号强度与核酸浓度的趋势一致。

②ELISA侦测小鼠血清过表达人源PNPLA3蛋白

小鼠眼眶采血做ELISA的前一晚，将小鼠禁食不禁水过夜。一早人源化PNPLA3 I148M转基因小鼠，维持小鼠活体，进行眼眶采血，分离血清且10倍稀释后，以人PNPLA3试剂盒应用双抗体夹心法按使用说明操作，依序配制标准品，将标准品与待测样品加入已被PNPLA3抗体包被微孔板的固相抗体，再加入HRP，显色后经由酶标仪450 nm波长读取OD值，通过标准曲线计算待测物的人PNPLA3蛋白水平。如图6，WT blank、核酸2.5、5、10 pmol/只，人PNPLA3蛋白水平依序为322.9 ± 53.05、482.4 ± 68.57、815.7 ± 104.41、1,361.0 ± 176.54 pg/ml，与Luc2讯号的趋势一致。然而，WT blank侦测到人PNPLA3蛋白水平有322.9 ± 53.05 pg/ml，可能是人源PNPLA3（Genebank ID:NP_079501.2）与鼠源PNPLA3蛋白（Genebank ID: NP_473429.2）的氨基酸序列相似性79%，人源PNPLA3 ELISA试剂盒人源PNPLA3抗体特异性不足区分鼠源PNPLA3蛋白所致。

③肝脏RT-qPCR侦测过表达PNPLA3 I148M mRNA

人源化PNPLA3 I148M转基因小鼠在高脂饮食8周后，禁食不禁水过夜，隔日一早安乐死15周龄小鼠模型到实验终点。肝脏组织匀浆后，秤取0.2g的肝匀浆液，以Trizol法（Invitrogen 15596018）提取总RNA，反转录（RT）成1st-cDNA。设计位于人源PNPLA3编码区第2个外显子为正向引物；反向引物则设计位于人源PNPLA3 I148M突变点，能特异性扩增含有该人源基因I148M突变cDNA而非野生型148I，进行qPCR鉴定mRNA水平，与鼠源Actin相对定量，WT blank 归为1倍，核酸2.5、5、10 pmol/只模型组，依序为3.1 ± 0.22、21.8 ± 2.10 和33.6 ± 2.61倍的人源化PNPLA3 I148M mRNA水平，高于野生型阴性对照且呈现剂量依赖性（图7），整体趋势与ELISA检测的人源PNPLA3蛋白（图6），以及Luc2讯号（图5）趋势一致。

④血清的血脂生化TG、CHOL、LDL-C

人源化PNPLA3 I148M转基因小鼠在高脂饮食8周后，禁食不禁水过夜，隔日一早安乐死15周龄小鼠模型到实验终点。采小鼠全血分离的血清，以全自动生化检验仪（日立，3110）检测3个主要的血脂生化检测指标TG、总胆固醇（CHOL）和LDL-C（表1），模型组的三个指标皆高于野生型阴性对照。其中TG指标，在野生型阴性对照、核酸2.5、5、10 pmol/只模型组依序为0.58、0.70、0.84和1.29 mmol/L，TG值与核酸浓度似有剂量依赖性。

本模型人源化PNPLA3 I148M 10 pmol/只转基因模型组的TG值为1.29 mmol/L、CHOL值为2.97 mmol/L和LDL-C值为0.34 mmol/L，远高于野生型阴性对照的TG值为0.58 mmol/L、CHOL值为2.02 mmol/L和LDL-C值为0.20 mmol/L，故以自动生化检测仪鉴定此模型的血清具备高血脂表型。

⑤病理鉴定肝脏呈现非酒精性脂肪性肝病典型表型

人源化PNPLA3 I148M转基因小鼠在高脂饮食8周后，禁食不禁水过夜，隔日一早安乐死15周龄小鼠模型到实验终点。解剖取出肝脏，用PBS清洗两遍，取一小片位置具有可比性的肝脏组织进行固定。通过苏木精-伊红染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)染色，肝脏病理鉴定出脂滴（Lipid droplet, LD）造成的空泡（透明圆形），呈现非酒精性脂肪性肝病典型的肝细胞气球样变的病理特徵。

野生型阴性对照的肝脏结构清晰，汇管区结构未见异常，可见中央静脉，肝细胞索排列整齐，未见炎症细胞浸润，未见肝细胞气球样变（图8A），评分为0分；然而模型组，肝窦开放，轻度充血，肝细胞索排列不整齐，多处局部小灶性炎症细胞浸润，多处肝细胞气球样变（图8B），根据SAF的肝细胞气球样变评分为1分；肝细胞脂肪变性评分，野生型阴性对照0分、模型组1分。龙传生物人源化PNPLA3 I148M 转基因模型组的肝脏病理同时存在肝细胞气球样变、肝细胞脂肪变且伴有轻度炎症，故鉴定具备NAFLD的病理表型。

(6) 龙传生物的人源化PNPLA3 I148M转基因NAFLD小鼠模型解决现有模型的限制

龙传生物人源化PNPLA3 I148M转基因伴随NAFLD的小鼠模型，解决现有模型的限制，具备①小动物活体成像实时侦测肝脏特异性外源基因表达讯号、②血清ELISA侦测过表达人源PNPLA3蛋白；③肝脏RT-qPCR侦测过表达PNPLA3 I148M mRNA，④血清的血脂生化TG、CHOL、LDL-C；⑤在15周龄病理鉴定肝脏呈现脂滴造成的空泡呈现肝细胞气球样变的非酒精性脂肪性肝病典型病理表型，以及⑥全程无需在生物安全二级实验室操作。本模型具备人源化PNPLA3 I148M编码区以外，尚具备已上市siRNA小核酸药物成药常用的3’UTR非编码区序列。除了蛋白药以外，特别适用于对于核苷酸序列有严苛要求小核酸药物新药研发的药效评价。

表1、龙传生物的人源化小鼠模型

	模型名称	指标	文章
1	实时可视性肝脏人源化PiZZ (SERPINA1 E342K) 疾病小鼠模型助力国内蓝海AATD药物研发	①D-PAS染色强阳性鉴定肝异常折叠的聚合物小球病理、②Luc2讯号、③RT-qPCR、④ELISA	点我查看
2	实时可视性肝脏人源化XDH小鼠模型应用箭头公司小核酸药物体内药效评价验证，助力痛风热门靶点的小核酸药物研发	①血尿酸>240 μmol/L、②肾炎病理和尿酸盐结晶沉积病理、血清BUN；③Luc2讯号、④RT-qPCR、⑤ELISA	点我查看
3	实时可视性肝脏人源化HAO1小鼠模型助力原发性高草酸尿症的小核酸药物研发	①血清生化肾损伤sUA、BUN和CREA、②Luc2讯号、③RT-qPCR	点我查看
4	实时可视性肝脏人源化PNPLA3 I148M+高脂饮食小鼠模型助力NASH/NAFLD热门靶点的小核酸药物研发	①脂滴造成的空泡呈现肝细胞气球样变的病理、②血清的血脂生化TG、CHOL、LDL-C；③Luc2讯号、④RT-qPCR、⑤ELISA	本文
5	人源化KRAS G12D原位肝癌裸小鼠模型	①RT-qPCR、②HCC解剖表型、瘤重；③病理	点我查看
6	人源化TP53 R249S 原位肝癌裸小鼠模型	开发中
7	实时可视性肝脏人源化AGT 助力高血压热门靶点的小核酸药物研发	开发中
8	高血脂热门靶点肝脏人源化小鼠模型	开发中
9	量身定制肝脏人源化小鼠模型	请联系商务
10	肺脏人源化小鼠模型	开发中

龙传生物提供服务的方式主要是小鼠生命周期闭环在杭州动物房，进行造模和药效评价，提供客户报告或组织；其他方式可讨论请洽商务。

参考文献（上下滑动翻阅）

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