1903年Tswett应用吸附原理有效分离了植物色素，自此拉开了现代液相色谱学的序幕。随着色谱学技术的飞速发展，液相色谱法至今已广泛应用于食品领域、制药领域、环境领域、生物疗法及生物群落研究领域。而液相色谱法的核心在于色谱柱，色谱柱的核心又在于色谱柱填料。故此，若要成为一名优秀的色谱分析者，有必要去了解硅胶颗粒的设计及硅胶颗粒表面化学修饰，并根据目标组分快速准确的选择合适填料的色谱柱至关重要。
目前市售的反相色谱柱大多以直径在1.7μm~10μm硅胶颗粒作为固定相载体。其内在原因可能是：1）硅胶化学性质比较稳定，不会与强碱和氢氟酸以外的物质反应，安全的pH使用范围一般在2~8，该范围一般能够满足大部分化合物的分析需求；2）裸硅胶（如图1A所示）以硅氧四面体(SiO₄)⁴⁻作为一个基本结构单元，无数个结构单元的桥联构成了宏观上的硅胶；众多未进行桥联的单元终端则形成硅胶颗粒的表面或内表面（如图1B所示）；而这些裸露的表面上存在大量可供功能团键合的-Si-OH位点（如图1C所示）。
图1 （A）硅胶颗粒SEM图；（B）孔隙局部放大SEM图；（C）孔隙表面分子排布示意图
接着-Si-OH键合位点往下聊。目前市场上主流的色谱柱技术资料上经常会看到这样的字眼：单官能团键合、双官能团键合以及三官能团键合。其键合方式可用如图2所示的原理图进行描述，即一当量-Si-OH与一当量的单氯代硅烷试剂发生单官能团键合；二当量-Si-OH与一当量的双氯代硅烷试剂发生双官能团键合；三当量-Si-OH与一当量的三氯代硅烷试剂发生三官能团键合。由单官能团键合至三官能团键合，其对酸的耐受程度是逐渐增加的，也就是说三官能团键合填料可以再更低pH的流动相中使用。此外需指出，等摩尔当量的硅醇基，由于键合方式的不同会存在碳载量方面的差异。理论上同一品牌同一类别的色谱柱，单官能团键合至三官能团键合其碳载量会呈现较小趋势，这也就是说载样量会呈现减少趋势。
图2 裸露硅醇基与氯代硅烷试剂键合原理图及耐酸程度示意图
图3 空间位阻效应示意图
为了提高色谱柱对酸碱及温度的耐受范围，需要减小酸碱侵蚀-Si-O-Si-的可能及几率，换言之，即需要减小硅胶基底溶解及键合相流失的可能和几率。如何去实现这一目标呢？其一，通过空间位阻效应来实现。其核心思想就是在硅烷烃侧链键合具有较大位阻效应的烷烃基团，如异丙基、异丁基等。示意图如图3所示。随着侧链疏水基团的位阻效应的增加，其对水合氢离子及氢氧根离子的屏蔽作用越强，侵蚀性离子愈难通过“屏蔽层”使-Si-O-Si-链断裂。从而保证在更宽的流动相pH范围硅胶不水解及键合相不流失。
其二，通过双齿键合实现。其核心思想就是先将两分子氯代硅烷试剂通过丙基链接，然后键合到硅胶表面。其示意图如图4所示。该技术亦可有效避免侵蚀性离子通过“屏蔽层”，继而使-Si-O-Si-链断裂
图4 双齿键合示意图
其三，通过亚乙基桥联杂化实现。其核心思想就是将氯代硅烷试剂通过亚乙基链接至硅胶表面。其示意图如图5所示。该技术亦可有效降低侵蚀性离子使键合相水解的风险。
图5 亚乙基桥联杂化示意图
其四，通过封端实现。其核心思想就是通过封端试剂（三甲基氯硅烷、六甲基乙硅氧烷、三甲基硅咪唑等）与残存的硅醇基反应，使水合氢离子及氢氧根离子难以水解硅胶基底。其示意图如图6所示。
图6 TMS封端示意图
至于上述增加色谱柱对酸碱耐受度的手段对标市售哪一款色谱柱不在本文讨论范围，有兴趣的可自行查阅资料。聊完减小硅胶基底溶解及键合相流失的方式方法后，我们来聊一聊常见的键合相。如图7所示，常用的色谱柱有C18（内嵌极性官能团的色谱柱如RP系列、AQ系列、T3系列等色谱柱未在表中体现）、已基苯基柱（五氟苯基柱未在表中体现）、丙基氰基柱、丙基氨基柱及离子交换柱。
图7 常用色谱柱类型列表及对应的填料示意图
图8 常用色谱柱对应的作用力
图9 特征官能团间存在的作用力
键合不同官能团的色谱柱对应的作用力如图8所示。特征官能团间存在的作用力如图9所示。当色谱柱无法有效分离多个组分时，可根据组分的特征官能团选择不同作用力的色谱柱尝试分离，如卤代化合物在常规C18色谱柱上无法分离时，可以尝试具有强偶极作用力的PFP色谱柱尝试分离。常见的C18/C8柱存在很强/强的疏水作用以及残存的硅醇基会带来弱氢键作用力，该类色谱柱对疏水性较强的化合物（LogD＞0）一般会有较好的保留，但在分析碱性化合物时，残存硅醇基引入的氢键作用会导致化合物会产生次级保留，从而造成色谱峰的拖尾，此时多重封端C18色谱柱可加以考虑。如在同一色谱条件下分析如表1所示化合物时，单封端分析弱碱化合物时存在明显拖尾，尝试双封端色谱柱拖尾明显改善。
RP-PEG色谱柱，存在较强的疏水作用、氢键作用及中等偶极作用，该类色谱柱在分析常规C18上弱保留或无保留的化合物（LogD＞-0.5）有显著优势，强氢键作用或偶极作用可以弥补疏水作用的不足，从而让化合物有效保留。如图9所示，在同一色谱条件下分析硫脲时，常规C18无法对其产生保留，而选择AtlantisTM dC18色谱柱时则可对其产生有效保留。
图9 常规C18与AtlantisTM dC18色谱柱同时分析硫脲
苯基柱以及五氟苯基柱存在中等强度的疏水作用以及强的π-π作用，此外五氟苯基柱还存在强的偶极作用。当在同一色谱条件下分析如表2所示的三个位置异构体时，常规C18无法通过疏水作用将其有效分离，而五氟苯基柱则可通过三者间的π-π作用差异将其有效分离。
综上，在了解色谱柱填料差异以及对应的作用力差异的基础上，根据化合物的特征官能团，快速而准确的选择合适的色谱柱往往能起到事半功倍效果。以上均为笔者在工作过程中的个人经验总结，若有纰漏望同行斧正。
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