包含非强制性建议

共轭雌激素生物等效性试验指导意见草案

本指导意见草案，如果最终定稿，代表的是美国食品和药品监督管理局（FDA）目前对该品种的思考。它并未建立或赋予任何个人任何权利，并非强制要求FDA或公众。可讨论本文建议以外的其他方法，只要所用的方法满足适用的法规要求。如果讨论本文建议以外的其他方法，请与FDA仿制药办公室的相关人员联系。

有效成分：	共轭雌激素
剂型/用药途径：	片/口服
推荐的研究方案：	2个

本指南草案为从怀孕母马尿中提取的自然来源的共轭雌激素片提供了建议。首先，FDA提供了支持活性药物成分(API)一致性的试验建议。第二，FDA为证明该产品的生物等效性提供建议。如果采用另一种方法来显示API相同或生物等效性，FDA鼓励申请者联系仿制药办公室(OGD)。

支持活性药物成分(API)一致性的试验建议

共轭雌激素是一种从自然来源获得的原料药。它含有从怀孕母马尿中提取的许多类固醇和非甾体成分的混合物。USP结合雌激素专论¹中定义了10个单独的甾体成分，以及在共轭雌激素说明书中可接受的标准。在USP共轭雌激素专论中建立了两种含量最多的成分(硫酸钠雌酮和硫酸钠马萘雌酮)的质量标准及其在片剂中的相对比例。USP专论中鉴别和定量方法为一种气相色谱法（GC）。样品的制备包括在GC前使用双(三甲基硅基)三氟乙酰胺进行硫酸盐共轭和化学衍生物的酶解。在过去的十年中，分析分离技术和质谱仪的性能有了显著的提高。在FDA的实验室中，使用液质连用(LC-MS)方法对两年期间生产的23批参比制剂Premarin^®片进行了分析。基于分析结果，FDA开发了一种LC-MS方法，可以识别出参比制剂中持续存在的含量最多的60个甾体成分，如下所述。可在比较物理化学特征的基础上建立一种评价与参比制剂(即怀孕母马尿)相同自然来源的共轭雌激素API一致性的方法。建议申请者使用USP GC方法，FDA的LC-MS方法，以及合适的内部方法来分析参比制剂和仿制制剂API/药物产品的不同批次。分析应该包括甾体和非甾体成分。应分别进行对每个参比制剂和仿制制剂的API/药物产品的至少6个不同批次进行检测。对于参比制剂批次，应研究在一年内生产的三种不同批次的参比制剂片剂(0.625 mg)，以评估其年内的一致性。类似地，应该研究在第二年生产的三种不同的参比制剂片剂，以评估两年内的一致性。这个分析需要六种不同的参比制剂片剂。申请者可以研究更多的参比制剂，以评估参比制剂的变化。对于仿制制剂，需要研究从一年内收集的怀孕母马尿液混合生产的三个不同批次的API，和从三个批次API（总共三个制剂批次）生产的一批片剂，以评估年内仿制产品的API及片剂制剂批次的一致性。类似地，应该研究三批不同批次的仿制产品API，以及从每个API批次中生产出的一批仿制药品，以评估两年期间的一致性。这个过程将覆盖6个不同批次的仿制批量API和6个不同批次的仿制片剂。

Ⅰ. FDA LC-MS分析方法

建议使用超高效液相色谱法和高分辨率谱法(UHPLC-HRMS)对共轭雌激素进行化学表征。

a. 材料：

质谱(Optima)级甲醇、水和甲酸或相当地水溶性UPLC BEH C18柱 1.7μm、130 Å、2.1 x150mm或相当地水溶性Sep-Pak C18、500mg或相当地雌酮-3-硫酸钠(E1-S)、马烯雌酮-3-硫酸钠盐(EqS)、∆^8,9-脱氢雌酮-3-硫酸钠盐(DHES)合成对照品。应采用正交方法验证对照品的特性和纯度(如HPLC、NMR和MS数据)。

流动相：

流动相A：水，0.1%甲酸

流动相B：甲醇，0.1%甲酸

b. 对照品的制备：

雌酮-3-硫酸钠(E1-S)、马烯雌酮-3-硫酸钠盐(EqS)、∆^8,9-脱氢雌酮-3-硫酸钠盐(DHES)

准备每个甾体对照品0.1 mg/mL溶液（以1:1的体积(v:v)水:甲醇配制）。将三种对照品溶液各100100 µL加至1mL小瓶中，然后用700µL流动相a稀释至总体积1mL。

c. 样品（片剂）的制备：

根据药片的规格，处理足够的药片至少得到3.6mg的共轭雌激素。对于0.625mg剂量，需要6片。称量药片，以确定每片的平均重量。将药片放入50mL的烧瓶中。添加15mL水，摇匀直到外涂层溶解，将水倒出，再加入15mL水快速冲洗。丢弃冲洗液，将药片转移到预加重的称重船。在室温下，用真空炉将药片干燥45分钟。称重后再在真空炉中放置30分钟，重复至恒重。确定平均片剂的重量。手工研磨或粉碎清洗过的药片。将含有相当于0.6mg共轭雌激素的片剂粉末转移至125mL烧瓶中。总量是根据洗涤干燥后的片子重量计算的。加入50mL水，在室温下保持两小时直到完全溶解(没有块状或粘性颗粒)。3000 g×15分钟离心去除任何固体微粒。固相萃取(SPE)取上清液。

SPE在Sep-Pak C18（500mg，产品编号WAT020805）中进行。使用3mL甲醇，再加上3mL5%甲醇溶液(甲醇:水，v:v)，溶剂为质谱级。将样品溶液通过柱子，再用3mL 5%甲醇溶液清洗。用3mL甲醇洗脱结合的样品，氮气吹干至终体积1.0mL。0.45µm尼龙过滤器过滤得到最终的共轭雌激素溶液。用流动相A1:5稀释样品用于检测。

d. 样品（原料）的制备：

对于没有辅料的原料药，将其溶解于15mL水中，并进行SPE纯化。

e. 仪器：

超高性能液相色谱高分辨质谱，包括超高性能的二元真空泵、真空脱气器、自动采样器、热定形柱室、电喷雾源和高分辨率质谱仪。

为了区分一个物种的单同位素质量和另一个物种的a +2同位素峰，2 m/z的单位，首选具有5万以上分辨率的质谱仪。

UHPLC 条件:

柱子: Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm, 130 Å, 2.1 x 150 mm, 编号186002353 或相当地 UHPLC USP L1柱子

流速: 0.35 mL/min

总运行时间: 70 minutes

进样体积: 1 µL, 环路体积 5-20 µL

柱温箱温度: 40° C

梯度程序：

Time (min.)	%B
0	21
5	33
45	53
60	98
65	98
65.5	21
70	21

质谱(MS)条件:

离子化方法:电喷雾电离(ESI)

条件:

扫描类型: MS,负离子模式

扫描范围: 250-700 m/z

系统适用性：

合成类固醇对照品的洗脱顺序应该是DHES, EqS, E1-S。检测的片段C₁₈H₁₉O₅S, DHES和EqS为m/ z347.0959； C₁₈H₂₁O₅S, E1-S为m/ z349.1115。E1-S的保留时间应在22-26分钟之间，DHES和EqS的分辨率(R)应大于或等于1.2，
使用方程（1）计算：R = 2 × ；其中tr为保留时间，w为第1和第2种化合物基线的5%峰高的宽度。每个甾体对照品的精密度(A)应在基于方程(2)的± 5 ppm范围内，
A = 2 × ×10⁶。

f. 样品分析和计算：

EIC中所有质量片段见表1,±5 ppm内的所有峰值区域均应被记录下来。使用质量和相对保留时间(RRt)与表2中的60个峰值相匹配。根据式(3)计算相对保留时间：RRt = Rt/Rt0。其中，Rt为化合物的保留时间，Rt0为E1-S的保留时间，这是在m/z 349.1115的共轭雌激素混合物中含量最高的化合物。如果保留时间长于37分钟，则使用式(4)计算保留时间：RRt = 2.25 x Rt/Rt1。Rt1 是m/z 399.2215峰的保留时间 (Rt1约为Rt0 x 2.25)。

在EIC列表中，将每个组分的峰面积除以60个组分的所有峰值区域，以获得每个组分的相对峰值面积。

g. 数据报告：

对于每个检测到的峰值，应该报告RRt和准确的质量。申请者还应根据准确的质量和RRt，在表3(共轭雌激素USP专论中确定的10个组分)中与适当的峰值相匹配。此外，每个峰面积的单位面积应与表2中所有60个组分的总和相关。将相对峰面积丰度以递减顺序在表中排列。

表1. EIC离子质谱中产生的质量(m/z)列表

EIC中的m/z
345.0802	379.1221
347.0959	381.1377
349.1115	385.1690
351.1272	387.1847
353.1428	395.1898
355.1585	397.2054
365.1064	399.2211
367.1585	413.2003
369.1741	415.2162
371.1898	465.2494
377.1064	511.2913

表2 共轭雌激素中60个甾体化合物

峰#	名称	RRt	质量m/z	组成
1	E1-Sa 和DEq3S17aa	1.000	349.1115	C18H22O5S
2	EqSa	0.937	347.0959	C18H20O5S
3	413@1.28	1.280	413.2003	C21H34O6S
4	399@2.25	2.250	399.2211	C21H36O5S
5	351@1.17	1.172	351.1272	C18H24O5S
6	E2-3S17aa	1.184	351.1272	C18H24O5S
7	415@1.22	1.218	415.2162	C21H36O6S
8	353@1.34	1.341	353.1428	C18H26O5S
9	397@2.21	2.212	397.2054	C21H34O5S
10	415@0.63	0.629	415.2162	C21H36O6S
11	EqnSa	0.859	345.0802	C18H18O5S
12	DEHSa	0.921	347.0959	C18H20O5S
13	369@1.73	1.732	369.1741	C19H30O5S
14	DEqn3S17aa	0.903	347.0959	C18H20O5S
15	349@0.90	0.901	349.1115	C18H22O5S
16	353@1.04	1.035	353.1428	C18H26O5S
17	465@1.71	1.710	465.2494	C25H38O8
18	511@1.18	1.182	511.2913	C27H44O9
19	369@1.14	1.135	369.1741	C19H30O5S
20	DEq3S17ba	0.928	349.1115	C18H22O5S
21	385@0.56	0.562	385.1690	C19H30O6S
22	371@1.48	1.476	371.1898	C19H32O5S
23	379@1.02	1.021	379.1221	C19H24O6S
24	413@0.86	0.855	413.2003	C21H34O6S
25	355@1.13	1.132	355.1585	C18H28O5S
26	413@1.90	1.896	413.2003	C21H34O6S
27	397@2.28	2.276	397.2054	C21H34O5S
28	413@1.05	1.045	413.2003	C21H34O6S
29	351@0.83	0.833	351.1272	C18H24O5S
30	365@0.91	0.906	365.1064	C18H22O6S
31	415@0.79	0.789	415.2162	C21H36O6S
32	415@1.10	1.102	415.2162	C21H36O6S
33	353@1.29	1.285	353.1428	C18H26O5S
34	415@0.72	0.723	415.2162	C21H36O6S
35	E2-3S17ba	1.015	351.1272	C18H24O5S
36	395@2.20	2.199	395.1898	C21H32O5S
37	399@2.29	2.287	399.2211	C21H36O5S
38	385@0.59	0.593	385.1690	C₁₉H₃₀O₆S
39	351@0.89	0.891	351.1272	C₁₈H₂₄O₅S
40	353@1.24	1.242	353.1428	C₁₈H₂₆O₅S
41	385@0.55	0.546	385.1690	C₁₉H₃₀O₆S
42	367@1.45	1.450	367.1585	C₁₉H₂₈O₅S
43	DEqn3S17b^a	0.790	347.0959	C₁₈H₂₀O₅S
44	387@0.73	0.725	387.1847	C₁₉H₃₂O₆S
45	387@0.68	0.682	387.1847	C₁₉H₃₂O₆S
46	395@2.11	2.113	395.1898	C₂₁H₃₂O₅S
47	413@1.11	1.111	413.2003	C₂₁H₃₄O₆S
48	413@2.07	2.067	413.2003	C₂₁H₃₄O₆S
49	413@1.14	1.138	413.2003	C₂₁H₃₄O₆S
50	413@1.01	1.010	413.2003	C₂₁H₃₄O₆S
51	351@1.10	1.105	351.1272	C₁₈H₂₄O₅S
52	511@1.86	1.863	511.2913	C₂₇H₄₄O₉
53	377@0.93	0.931	377.1064	C₁₉H₂₂O₆S
54	385@1.11	1.107	385.1690	C₁₉H₃₀O₆S
55	367@1.19	1.193	367.1585	C₁₉H₂₈O₅S
56	413@2.03	2.029	413.2003	C₂₁H₃₄O₆S
57	385@0.62	0.622	385.1690	C₁₉H₃₀O₆S
58	381@1.19	1.193	381.1377	C₁₉H₂₆O₆S
59	413@1.23	1.228	413.2003	C₂₁H₃₄O₆S
60	413@1.06	1.064	413.2003	C₂₁H₃₄O₆S

Ⅱ.API的一致性

建议建立从怀孕母马尿液中提取的共轭雌激素的标准，包括定性和定量标准。申请者应该报告，使用FDA LC-MS方法，始终出现在水平≥0.1%的所有甾类组分(相对峰面积的百分比,详见（h)数据报告)。

a.甾体成分的鉴定试验

所有的受试API批次都应该包含由FDA LC-MS方法确定的60个甾体成分(表2)。所有的组分都应该通过RRt和精确质量来确定。

b. USP中10个甾体成分的量化试验。

所有的受试API批次中都应该包含在共轭雌激素USP专论中指定的10个甾体成分，且应符合标准。可以接受使用USP GC方法或经过验证的内部方法获得的数据。

c.非usp的主要甾体成分的控制。

参比制剂中出现的非usp收录的所有甾体成分(水平≥1%，相对峰面积的百分比,详见（h)数据报告)non-USP均应在受试API批次中进行检测，并且其水平应与参比批次相当。否则，应该证明其结构或对其定量。

d.在受试API批次中其他甾体成分的控制。

受试API批次中出现的任何任何水平≥1%的甾类成分(相对峰面积的百分比,详见（h)数据报告)，但在参比批次中的水平不是一直保持≥1%,应该证明其结构或对其定量。

e. 总甾体成分含量检测

由FDA LC-MS方法(表2)确定的60个甾体成分的总和(LC-MS峰面积)与60个甾体组分的比值(表2)为如下所示：比值=。从受试API批次和参比批次的比值水平应相当，否则应证明其合理性。

f. 受试API批次中的非甾体类成分

受试API批次中的非甾体成分应作为共存成分进行处理，并与参比批次进行比较分析。应设置适当的验收标准，以便在受试和参比批次之间比较非甾体成分的水平。工业界ANDA指南中：和as的指导:可将非甾体成分作为药物中的杂质来设定接受标准。

推荐的生物等效性方案：4个试验

可基于以药代动力学为终点的体内试验建立生物等效性。推荐4个体内BE试验。

1．研究类型：空腹

试验设计：单次给药、交叉、四周期重复体内试验

给药剂量：1.25mg

受试者：正常健康的绝经后或者是手术不育的女性。

附注：在单剂量空腹研究中，建议采用重复研究设计(TRTR和RTRT)来区分不等分序列和携带效应。这两个序列的使用(TRTR和RTRT)是最佳的平衡和最小化偏差的设计，应该在研究中存在不平等的携带效应。一个非重复的(双向交叉)研究设计可以代替重复研究设计，但是具有统计学意义的序列效应的出现可能会对产品的生物等效性结论产生怀疑。

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2．研究类型：餐后

试验设计：单次给药、交叉、四周期重复体内试验

给药剂量：1.25 mg

受试者：正常健康的绝经后或者是手术不育的女性。

附注：如果初始提交的ANDA中剂量低于1.25 mg，则该研

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3．研究类型：空腹

试验设计：单次给药、双交叉、四周期重复体内试验

给药剂量：0.625 mg [0.625 mg x 2 片 (剂量：1.25 mg)]

受试者：正常健康的绝经后或者是手术不育的女性。

附注：如果在最初的空腹研究(研究1)中没有发现有统计学意义的明显携带效应，本研究的非重复设计是可以接受的。

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4．研究类型：空腹

试验设计：单次给药、双交叉、四周期重复体内试验

给药剂量：0.9 mg [0.9 mg × 2 片 (剂量: 1.8 mg)]

受试者：正常健康的绝经后或者是手术不育的女性。

附注：a. 在进行BE试验前提交BioIND申请[见 21 CFR § 320.31(b)(1)]；b. 其他参见试验3.

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待测分析物（在适当的生物体液中）：血浆中基线校正后的非结合型雌酮，总雌酮，非结合型马烯雌酮和总马烯雌酮

非结合型雌酮和总雌酮的分析测定采用基线校正的方法。测定给药前48，24，0个小时的非结合型雌酮和总雌酮水平，以消除内源性噪音干扰。采用给药后浓度减去非结合型雌酮和总雌酮给药前浓度的平均值的基线校正方法。总马烯雌酮是未结合的马烯雌酮、马烯雌酮硫酸盐和马烯雌酮葡糖苷酸的总和。马烯雌酮在人体中不是内源性的，因此基线血浆水平为零。

生物等效性评价依据（90% CI可信区间）：72小时内血样品中基线校正的非结合型雌酮，基线校正的总雌酮，非结合型马烯雌酮和总马烯雌酮

体内试验的豁免要求：0.3 mg和 0.45 mg 规格符合以下条件的可以申请豁免：（i）剂量为0.625mg时生物等效性试验数据符合要求（ii）所有剂量组的处方比例相似（iii）所有剂量组的体外溶出试验数据理想。

溶出度试验方法和采样方法：

FDA仿制药办公室（OGD）网站公开溶出度试验方法数据库（http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/dissolution/）。请在上述网站查找本产品的溶出和崩解信息。请用所有规格各12个制剂单位的样品进行溶出度和崩解度对比试验（受试制剂和参比制剂）。技术参数由对申报资料的审评情况确定。

Conjugatedestrogens(共轭雌激素)生物等效性指导原则草案

共轭雌激素生物等效性试验指导意见草案

溶出度试验方法和采样方法：

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