本文为“你用的滤芯，选对了吗？”系列文章。

上期“液体制剂滤芯的选择之吸附试验”对滤芯相容性研究的5大板块吸附试验、细菌截留试验、化学兼容性试验、可提取物或浸出物试验、安全性评估中的吸附试验进行了简单介绍。回顾上期内容，在滤芯吸附试验板块，滤芯的选择，首先要充分考虑滤膜的适用范围，包括过滤溶液的pH值范围，过滤溶液的组成成分，过滤器应用的场景等，其次考虑滤芯材质与原料、辅料的相互作用，充分考虑过滤器与药液的兼容性。

本文作为“你用的滤芯，选对了吗？”续集，结合滤芯相容性研究的细菌截留试验板块，继续探讨滤芯该如何选择？

众所周知，在液体制剂研发中，特别是非终端灭菌的品种，滤芯的选择尤其重要，直接关系到品种的无菌保障水平。例如冻干粉针通过滤芯过滤除菌，部分不能耐受终端灭菌的小容量注射剂通过滤芯过滤除菌。

从品种的角度，如何论证非终端灭菌品种的无菌保障水平？从滤芯的角度，如何论证细菌截留试验的有效性？

依据最新版药品GMP相关法律和法规、欧盟GMP指南、美国FDA《无菌工艺指南》及《除菌过滤技术及应用指南》等相关法规和指南的要求，用于非终端灭菌品种的滤芯需要开展细菌截留试验研究。

细菌截留试验研究包括哪些内容？

一、影响细菌截留的因素

首先是微生物的性状和大小；

其次是药液的性质，包括渗透压、离子强度、pH值、表面活性剂占比、有机成分占比、抑菌或杀菌成分的占比等；

然后是滤膜的性质，包括孔径分布、表面化学成分。微孔结构等；

最后是药液通过滤膜的压差、时间、温度、批量等。

影响细菌截留的因素详见下图：

图1：影响细菌截留的因素

二、细菌截留的研究方式

细菌截留的研究方式一般有两种：

直接法和间接法。

在开展细菌截留研究前，要先确认药液对细菌的影响。确认药液对细菌的影响分为4步：

第一步

在生产工艺条件下,将挑战菌直接加入到产品中,并在工艺条件下进行培养。

第二步

检测产品中挑战菌的存活率。

第三步

根据挑战菌在测试液和对照液中的LRV值不同,可以将测试液分成杀菌性产品、非杀菌性产品和中度杀菌性产品三种。

第四步

如果产品为非杀菌性产品,则细菌挑战测试的方式为直接将挑战菌加入产品中进行挑战;

如产品为中度杀菌性产品或杀菌性产品,则需要建立滤芯或滤膜的冲洗方案,验证产品残留对细菌生存性的影响,并选择合适的替代液代替客户产品进行细菌挑战测试。

图2：细菌截留研究方式——直接法

图3：细菌截留研究方式——间接法

判断标准

1、在工艺时间内活菌数下降<1log,确定测试药液为非杀菌性产品。

2、1h内活菌数下降<1log，但是在工艺时间内活菌数下降≥1log,确定测试药液为中度杀菌性产品。

3、1h内活菌数下降>1log,确定测试药液为杀菌性产品。

4、恢复生长的菌落数必须在 20~200 cfu 才可作为有效计数结果。

三、细菌截留试验需要考虑的方面

1、在除菌过滤验证中使用滤膜还是滤器,取决于验证的目的。如果微生物截留试验的目的是验证过滤工艺中特定膜材的细菌截留效能,那么使用滤膜是能满足需要的。微生物截留试验中所用的滤膜必须和实际生产中所用过滤器材质完全相同,并应包括多个批次(通常三个批次)。其中至少应有一个批次为低起泡点(低规格)滤膜。

2、为了在微生物挑战试验中实施最差条件,一般需要使用完整性测试的数值非常接近过滤器生产商提供的滤器完整性限值的滤膜(例如不高于标准完整性限值的110%) 。如果在验证中没有使用低起泡点滤膜,那么在实际生产中所使用的标准溶液滤膜/芯起泡点值,必须高于验证试验中实际使用的滤膜的最小起泡点值。

3、成分相容、只有浓度不同的系列产品可以通过挑战极限浓度和接受中间一组浓度来验证。

4、一般来说重复使用过滤器是不实际的，如果重复使用除菌级过滤器，应该给出充足里有并且重复使用参数经过充分论证。

结合细菌截留试验的研究内容，关于滤膜孔径选择和滤芯组合系统选择，本文推荐如下：

关于滤膜孔径的选择，在这里，要先科普一下，世界上最小的细菌是缺陷型假单胞菌（直径大约为0.3—0.4微米，长度0.6—1.0微米）。在除菌过滤验证中，缺陷型假单胞菌必须是单一的、分散的细胞，才能作为细菌截留试验的标准挑战微生物。所以只有过滤器孔径小于缺陷型假单胞菌的尺寸时，才能保证对最小微生物的截留能力。一般情况，除菌过滤工艺应选用0.22微米（更小孔径或相同过滤效力）的除菌级过滤器。

滤芯组合一般分为两种：序列过滤系统和冗余过滤系统。

通常通过两个或以上相同或递减孔径的过滤方式，统称为序列过滤系统。例如：0.45μm过滤器+0.22μm过滤器。序列过滤系统中，如果在最终除菌过滤器前增加一个除菌级过滤器，并且确保两个过滤器之间无菌，以及控制过滤前介质的微生物污染水平一般小于等于10cfu/100ml，这种情况下称为冗余过滤系统。例如：0.45μm过滤器+0.22μm过滤器+0.22μm过滤器。

总之，通过细菌截留试验研究和论证，除菌过滤工艺应选用0.22微米（更小孔径或相同过滤效力）的除菌级过滤器，除菌过滤工艺一般选择冗余过滤系统，达到更高的无菌保障水平。

推荐阅读：液体制剂滤芯的选择之吸附试验

参考文献：

1.American Society for Testing and Material. Standard Test Method for Determining Bacterial of Membrane Filters Utilized for Liquid Filtration. 1993 ASTM Standard and Environmental Microbiology,Second Edition, Designation F838-83, pp 50-55.

2.Center for Drugs and Biologics and Office of Regulatory Affairs, Food and Drug Administration. Guideline on Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing. September2004.

3.PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology: Technical Report No. 26, Sterilizing Filtration of Liquids, March 1998.

4.国家食品药品监督管理局,药品生产质量管理规范(2010年修订) [S].2011

5.国家食品药品监督管理局药品认证管理中心,无菌药品:药品GMP指南[S].2011

6.国家药品监督管理局.除菌过滤技术及应用指南(2018年第85号通告) [2].2018-07-31

7.国家药品监督管理局,除菌过滤技术及应用指南，2018

8.Parenteral Drug Association(PDA), Sterilizing filtration of liquids technical report No.26,2008

9.General Information Chapter<1227>,Validation of Microbial Recovery from PhamacopeialArticles, USP 28,USPC,Inc.,Rockville,MD,2005,p. 2752

10.American Society for Testing and Materials (ASTM) Standard Test Method for Determining Bacterial Retention of Membrane Filters Utilized for Liquid Filtration F838-05,pp1-6,ASTM,WestConshohocken,PA,2005.

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