作为成药性评估（可开发性评估）非常重要的维度，蛋白自相互作用有着举足轻重的地位，那些具有高自相互作用的分子，容易导致大分子聚集或颗粒，产生非特异性吸附，也与体内半衰期短、高免疫源性相关，对工艺开发的开发和维持良好的稳定性造成巨大挑战。
作为这个系列的开篇，选择了先讲方法论，让各位读者能直接应用到实际案例中
首先辨析一组概念，当我们再进行稳定性评估时，常会得到一组概念，胶体稳定性和构象稳定性，目前市面上也有一些集成设备将测定Tm、Tagg、Tsize等参数的融合到一起，进而告诉我们Tm是用于评估构象稳定性，Tagg可用于评估胶体稳定。前者是正确的，Tm是折叠展开一半时的温度，可以判断构象稳定性；但后半句也对也不对，部分可以反应折叠状态下聚集情况，但主要的还是蛋白解折叠后的聚集情况，。而真正治疗性蛋白药物，主要还是在低温保存，热解折叠部分比较少，或许会有部分化学解折叠，但更主要还是本身的自相互。
如图1所示，本系列会更集中介绍native条件下的自相互作用。
图1抗体随温度变化产生的变化反应以及相关检测方法
溶液中蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的重要贡献者是氢键、空间(不包括体积)、静电、范德华和疏水相互作用。可见可以有多个维度去评估这些，也随之诞生了各类方法。
一、kD、B22和G22
这三个参数是目前非常主流用于评估自相互作用的参数，下表总结了三个参数的定义和应用场景。
图2 kD、B22和G22的区别—摘在unchained labs培训手册
温故而知新，之前培训时没特别在意B22和KD的差别，反正不管怎么样，让它刚“正”不阿就是最好的。但有时两者不一定同时为正值或负值，所以需要根据应用目的不同，应该对症解决。
图3 KD和B22关系图
（一）KD：测量蛋白-制剂复合物
通过观察扩散系数随浓度增加，如果蛋白质的相互作用随着浓度的增加而增加（相互吸引），那么蛋白质的行为就好像它们变大了，扩散系数也降低了（负斜率）。如果蛋白质的相互作用随着浓度的增加而减少（相互排斥），那么蛋白质的行为就好像它们变小了，扩散系数也增加了（正斜率）。
（二）B22测量蛋白-蛋白相互作用（仅蛋白质-蛋白质相互作用）
B22与kD相似，但排除了一些蛋白质溶剂效应，沉淀效应以及热力学现象，盐、pH、温度的改变会影响到这些相互作用，有下图公式可知，是由蛋白表观分子量影响。
B22的快速方法是通过观察KC/R90来测量，这就像是观察1/R90。B22测量1/R90如何随着浓度的增加而变化。如果蛋白质的相互作用随着浓度的增加而增加（相互吸引），那么蛋白质的行为就好像它们更大，1/R90减少（负斜率）。如果蛋白质的相互作用随着浓度的增加而减少（相互排斥），那么蛋白质的行为就好像它们变小了，1/R90增加了（正斜率）
本人看到公式也比较晕，目前工作更偏应用，所以可能来点实战的。
早期可开发性评估和制剂工艺开发侧重点不同，但蛋白必须在一定的处方下才能评价，处方又对数值有影响，所以需要甄别考虑。
也许你只能测kD，正好今天看到一篇2011年的文献，有个公式换算，其是根据得到的8个抗体在含盐和不含盐的条件下做出的拟合曲线。最后得到的方程式
kD=1.06 A2*M-8.9。(A2即B22)根据这个公式也有学者认为，kD=-8.9以下即可认为B22为负值，该蛋白自己即存在自吸引。
这个还没验证过，各位读者可再验证，期待分享后续结果。
图4 kD与B22经验公式换算图
二、Zeta电位
图5双电层模型示意图——《Zeta电位的基本理论、测试方法和应用》
（一）原理：如图5所示，最左侧的“surface charges”可看成分散在水中的固体粒子的表面电荷。悬浮在水中的粒子，其表面的带电基团总是倾向于吸引溶液中带相反电荷的离子(即"反离子")。但所有的离子都具有热能，所以它们会不停地运动。所以离子一方面在静电作用下被吸引到粒子表面，另一方面在热扩散的作用下远离粒子表面，这两种作用的净效果是所有离子在颗粒表面获得某种平衡分布，这种平衡分布也就是形成了离子云。
值得注意的是，图中有一层反离子被画成与粒子表面直接接触，即它们处于所谓的紧密层(Condensed layer)中，而另外的反离子被画成是扩散的，即处于所谓的扩散层(Diffuse layer)中。紧密层和扩散层相接的地方存在一个滑移层(处于距离紧密层朝外方向很短的地方)，大致地我们可以这样认为：粒子在水中运动的时候，滑移层左侧的离子都能跟随粒子一起运动，而其右侧的粒子则没有那么"死心塌地"地跟它走，所以两者之间会产生滑动。在此处，Zeta电位指的就是水相中固体粒子的滑动面相对于远处(即离子平衡处)的电位(Electrical potential)，这个电位通过仪器是可以实际测到的。
（二）数据解读：Zeta电位仪检测得到的是正值，就说明蛋白整体表现出来的是正电荷；反之则带负电。Zeta电位是对颗粒之间相互排斥或吸引力的强度的度量。分子或分散粒子越小，Zeta电位的绝对值（正或负）越高，体系越稳定，即溶解或分散可以抵抗聚集。反之，Zeta电位（正或负）越低，越倾向于凝结或凝聚，即吸引力超过了排斥力，分散被破坏而发生凝结或凝聚。因而对于常规条件下，我们会使抗体带正电荷，因而zeta电位数值越大，会有更大的静电排斥，从而降低聚集率。
三、荧光光谱
图5芳香族氨基酸最大吸收波长和相应吸收系数。
蛋白内主要有三种芳香族氨基酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸。芳香族氨基酸为疏水氨基酸，天然状态下大多是包裹在蛋白内部，仅少量暴露于外部，当蛋白变性后会暴露在极性溶液中，这也是DSF方法测定Tm的原理。
色氨酸的对于蛋白荧光的影响最大，通过荧光光谱检测，若出现红移（最大纳米数增加）表示色氨酸更易于分布在表面，易导致色氨酸介导的疏水作用力导致的蛋白相互作用。
图6不同抗体荧光光谱图—取自文献3
四、AC-SINS亲和捕获自相互作用纳米粒子
图7 AC-SINS不同自相互作用的检测示意图
原理：通过金纳米颗粒包被抗人Fc的抗体后，加入待检测含人Fc的待测抗体后，与抗Fc抗体结合，若待测蛋白Fab区域发生自聚合则会拉进纳米颗粒的距离，产生最大吸收波长红移，反之则产生蓝移。通过检测最大吸收波长，来确定待测抗体自身自相互作用情况。
请注意，上述提到，此方法测定的主要是有Fab区域介导的自相互作用，非Fc区域。但根据文献报道，Fab区域也是各抗体间不同的部分，也是主要自相互作用的主要来源，因而该方法测定的值可以客观反应整个分子的情况。
五、其他方法
除了上述提到的方法，还有如下方法可用：
01.方法预测对比
如上所示，存在着很多方法，通过不同原理去评价抗体自相互作用，每个方法所需仪器设备、试剂不同，决定了检测成本和通量，另一方面，这些方法的预测性是否准确，是另一个更重要的考量维度。2021年恒瑞医药发表了一遍文章，以7个单抗及三个抗体复方为样品，比较了四个方法的情况。
图8样品信息
图9检测数据
从上述结果可知，荧光色谱与SEC结果没有相关性，zeta电势有一定的相关性，但也有两个样品特例，kD和AC-SINS均展现了，较好的相关性。（文中用单体量monomer作为横坐标，若是改成HMW，则kD象限中mAbE也是符合预期的）。
图10四种检测方法与SEC数据的排序情况
文献作者又分别对四种方法的预测值和最终实验所得的SEC-monomer变化率结果进行排序对比，可看到AC-SINS的预测排序是与SEC排序结果最接近的。（UP主觉得，用monomer做排序并不是非常合理，自相互作用主要影响聚集情况，所以用HMW或许更好）。
在其他文献中其实也报道了各方法的相关性，如下图所示，AC-SINS、KD、粘度、溶解度之间其实都有比较好的相关性。
图11 kD与AC-SINS粘度和溶解度的关系图
02.最后回到最实用的两个问题
（一）那么哪种方法最合适？
这没有标准答案，根据各实验室的仪器配置情况、通量、检测目的等来决定（具体方法参数可参考文献，篇幅有限不做详细介绍，后续可再开篇介绍），个人看到的是AC-SINS和kD比较多，可做参考。
（1）但建议不选荧光光谱，因为色氨酸暴露只是自相互作用的一个方面，还有电荷，同时相比单个氨基酸，疏水patch会更影响疏水性；
（2）zeta电势，从上述的结果也并不是很有代表性，up主看到的文献能较好预测自相互作用的案例不多，所以也不是很推荐。
（3）另外目前文献多集中在单抗，双抗、纳米抗体、ADC等新型结构是否通用，可进一步关注和验证。个人体会看类型，会有差异。
（二）方法阈值——低于哪个值就认为样品自相互作用很大？
（1）如何判断自吸引或排斥已在前文描述，而对于阈值，各个文献有不同的标准，比如针对AC-SINS，有文献以5，有文献以10，也有看到以11.8。原因是每个实验室的实验过程或多或少有差异，会直接导致方法的灵敏度，UP主有开发过AC-SINS，改变某个值，同一个样品检测数值均会有差异，所以没有一个固定值。
（2）超过阈值就一定不可行吗？其实也不绝对，只是会增加工艺开发和稳定性风险，有多篇文献报道目前市售和临床期间的一些抗体，也有将近1/3有一些交叉或自相互作用的风险问题（如大家熟悉的T药-Atezolizumab，其CIC、CSI、AC-SINS都不太好）。所以这个维度只是排序，在保证有效（功能活性）的基础上，尽可能挑选自吸引低的分子，进一步保证安全和稳定。
图12市售和临床抗体交叉或自身相互作用的缺陷标记热图
方法篇介绍完毕，知识有限，必定有遗漏或理解偏颇，请留言或加V沟通交流，在交流中成长，这是写文章和创公众号的初衷之一。
参考文献：
1、Uncle培训手册
2、Penta培训手册
3、Application of affinity-capture self-interaction nanoparticle spectroscopy in predicting protein stability, especially for co-formulated antibodies
4、Assessment of Net Charge and Protein–Protein Interactions of Different Monoclonal Antibodies
5、基于抗体序列的可开发性相关理化性质风险预测
6、Zeta电位的基本理论、测试方法和应用
7、Predicting Antibody Developability Profiles Through Early Stage Discovery Screening
洪观杰析专栏简介
专栏主理人:程洪杰——CPU随风而逝 中国药科大学本硕连读，在抗体行业拥有十余年经验，在新药发现、成药性分析、蛋白纯化、制剂开发、分析方法开发和质量控制均有丰富经验。参与过Etanercept、infliximab、dulaglutide等多个生物类似药以及多种单抗、双抗、融合蛋白新药的CMC研究，并成功将多个产品推向临床。
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