微生物限度检查法及其方法学验证

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2005-10-24

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审评三部王伟萍

摘要：本文从四个方面介绍2005版微生物限度检查法增修订内容，重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证，提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的微生物限度检查法进行方法学验证，以增加试验方法的完整性、保证检验结果的可靠性。
关键词：微生物限度检查法方法学验证

微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。与2000版相比，2005版微生物限度检查法在以下几方面进行了增修订。
一、标准的制订原则：
2000版微生物限度法标准细菌数、酵母菌数和霉菌数按剂型制订，控制菌按给药途径制订。由于同一剂型有不同的给药途径，且随着新剂型的不断出现，按剂型制订标准具有局限性。2005版均按给药途径制订，解决了这一局限性，不会因剂型的改变而带来执行标准的混乱。
二、标准的分类：
分为三大类，即制剂通则项下规定；口服给药制剂；局部给药制剂，其中化学药部分（二部）包括：1、制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂；2、口服给药制剂3、局部给药制剂：眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂。中药部分（一部）包括：1、制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂；2、口服给药制剂：不含药材原粉的制剂；含药材原粉的制剂；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂；3、局部给药制剂：用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂；用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂；眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂。
三、微生物限度检查方法的增修订：
1、明确了环境检测执行的标准和方法，洁净度要求及洁净度定期检查；
2、检验量：随机抽取不少于检验量（两个以上最小包装单位）的3倍；贵重、微量样品检验量可酌减；要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml；
3、供试液制备：表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物生长和存活无影响；供试液从制备至加入检验用培养基不得过1小时；供试液体积为100ml；非水溶性供试品：增加“十四烷酸异丙酯法”；结肠溶制剂的供试品：用pH为7.6无菌磷酸盐缓冲液溶解；具抑菌活性的供试品：增加方法的可操作性。
4、灭菌：培养基及稀释剂采用验证合格的灭菌程序进行灭菌。
5、稀释剂：增加pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液、pH 6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH 7.6无菌磷酸盐缓冲液；
6、细菌、霉菌及酵母菌计数；7、控制菌检查：新增大肠菌群检查法、梭菌检查法。
四、微生物限度检查法的验证：
微生物限度检查法验证的目的是确认所采用的方法是否适合于供试品的微生物限度检查。验证的内容包括准确性（回收率）、专属性。验证的类型分为前验证（建立微生物限度检查法时的验证）和再验证（修订检验方法后、供试品组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时、定期的方法验证），根据检查方法的不同，又分为细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的验证。
1、细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。验证菌株为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌。菌种要求不得超过5代，菌液制备为50－100cfu/ml。验证方法分试验组、菌液组、稀释剂对照组、供试品对照组，具体方法如下：
1）试验组：平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。
2）菌液组：测定所加的试验菌数。
3）稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
4）供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
5）结果判断指标：计算供试品组的菌回收率、稀释剂对照组的菌回收率。A、在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。B、若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，按此该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。C、若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。
2、控制菌检查法的验证
试验菌株按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。大肠菌群检查用大肠埃希菌；梭菌检查用生孢梭菌。阴性对照菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌用大肠埃希菌；大肠埃希菌、沙门菌、大肠菌群用金黄色葡萄球菌。菌种的要求：不得超过5代。菌液制备为10～100cfu。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。具体如下：
1）试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。
2）阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组检出。
3）结果判断：阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。
我们在审评工作中发现部分制剂本身具有抑菌或杀菌作用，如某些眼用软膏剂，某些含生物碱的中药复方制剂等，所制备的供试液本身具有影响微生物生长的作用，若不经方法学验证，难以保证所采用方法的适合该供试品的微生物限度检查，难以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
以上介绍2005版微生物限度检查法增修订内容，重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证，提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的微生物限度检查法进行方法学验证。