日本药物生殖毒性试验技术指导原则简介

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2005-09-22

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审评四部王庆利

摘要：日本是受沙利度胺危害最大的国家，对其具有深远的影响。直至近日，日本对药物生殖毒性的要求依然是ICH三方最为严格的一方。1963年日本制定了最初的胎儿试验法，1965年进行了修订。1975年进行了全面修订，制定了所谓的三段生殖发育毒性试验法，并在1984年和1988年进行了部分修正。在1993年接受ICH生殖毒性指导原则。其后日本对生殖毒性试验方面进行了深入的研究，特别是在雄性生育力试验方面作出了积极的探索，其研究的相关结果被纳入了ICH指导原则中。2002年日本发布了生殖发育毒性试验的最新版本，本文介绍了该指导原则的主要内容。
关键词：日本药物生殖毒性试验技术指导原则

基本目的
利用哺乳动物检验药物可能存在的一些对生殖发育的不良影响，并公开这些不良的影响，以用于对人的生殖发育的安全性/危险性的评估。
试验方案
三段试验方案是最实际的选择，通过限定给药时间来识别有可能发生损害的生殖发育阶段，该方法在一般情况下几乎对所有的药物都有效。但应根据药物特点、适应症、适用人群、药代动力学资料、其他药理毒理资料等方面进行科学灵活的考虑，如单一试验方案或两段试验方案等。无论选择何种研究方案，必须能充分暴露和评价药物的生殖毒性，并应说明选择的依据。
试验动物
不同的动物种属对药物的反应有很大差别，为了充分暴露毒性，更准确地外推至人，最好尽可能选用多种动物。但是从经济或其他的理由来看，选择多种动物是不现实的。在选择试验动物的时候应考虑：①是否宜于做为人类疾病模型。②受试物的代谢方式与人相类似。③由于在生殖毒性试验开始之前就清楚受试物在人体的代谢方式往往是很困难的，故通常使用那些操作比较容易，而且对其一般的代谢方式和生殖生理非常熟悉的动物。④对动物自发畸形的了解和对已知的能诱发生殖毒性物质的敏感性。
大鼠作为试验动物使用的历史很长，有关其生殖生理的知识及其一般代谢方式已经相当清楚，具有性成熟期、妊娠期和哺乳期都比较短的优点，是生殖毒性研究中获得经验最丰富的动物，背景资料较多。
由于致畸敏感期毒性导致的毒性后果相对更严重，日本对致畸敏感期试验特别重视，认为使用多种动物进行试验，在结果类推于人时，能够提供更为充实的试验结果支持。因此，要求啮齿类动物和非啮齿类动物要分别使用一种以上。家兔是首选的非啮齿类动物。家兔体形较大，胎仔观察比较容易，给予可致胎儿畸形的药物酞胺哌啶酮，可引起和人类似的畸形。同时，该段试验使用家兔经验丰富，背景资料较多。
动物数
未说明具体动物数的要求。应考虑：①动物对受试物的敏感性，②所采用试验方法，③所要求的精确性等。但通常每组16～20只动物用于评价，国内外取得了一致。
给药途径和频率
原则上是使用与人相同的给药途径。有多种给药途径时，首先应考虑能够出现最强反应的给药途径。选择与临床不同的给药途径时，应提供依据。①经口给药，通常使用胃管强制给药。掺食法由于动物的摄取忌避，往往达不到所期待的剂量，或是给药的剂量不准确，一般不采用。②注射给药必须注意受试物的性状及其局部毒性。静脉注射要注意注射的速度和防止药液的泄漏。使用稳定的注射速度是重要的。腹腔内注射可能会对子宫直接产生作用，或是造成对胎仔胎盘移行，在对妊娠期动物试验时，一般不用这种方法。③有时也使用皮下或肌肉内注射给药。④对于临床上局部应用（皮肤、点眼、点耳、坐剂等）的药物，可采用其他给药途径代替。皮肤给药时，应避免动物舔皮肤或摩擦笼子。脱毛的皮肤上发生损伤时，会造成吸收差异，应充分注意。作为皮肤给药的替代途径，往往采用皮下注射，这与皮肤的吸收途径相类似。
生殖毒性试验应每日给药。在分段试验中，注意各段间要设定至少一天的重复期。
给药剂量
试验目的是研究是否会对动物生殖发育带来不良的影响，研究剂量反应关系及其无毒性剂量。故尽量采用多个剂量，不能拘泥于三剂量设计。为了明确剂量反应关系，设置较窄的剂量间距是适宜的。适当预试验会为药量选择提供科学依据。非妊娠和妊娠动物间往往是有毒性差异的，故预试验首先采用非妊娠动物，然后用妊娠动物，这样能够更多地得到有用的信息。
通常把每日1g/kg作为给药剂量的上限。
对照组
阴性对照的试验结果是分析整个试验结果的必需资料。根据试验者的判断可设计阳性对照或比较对照。不适宜使用对生殖发育有致畸等不良影响的物质作为溶剂，如果不清楚溶媒和乳化剂对生殖发育的影响时，最好设计无处置对照组。
给药时期
一般生殖毒性试验中雄性动物交配前给药的时间，被认为是涵盖精子形成全过程和精子成熟所需要的时间。但是，根据以日本为中心的的国际共同研究结果，如果有雄性动物生殖器官的病理组织学检查，缩短交配前的给药时间是可能的。目前雄性动物交配前的给药时间定为2周或4周。对2周以上的重复给药试验，对雄性动物生殖器官实施适当的病理组织学检查，如果未见不良影响，雄性动物交配前的给药时间可定为2周，但应就时间设定的理由和妥当性进行阐述。
药代动力学资料的运用
关于生殖毒性试验药代动力学资料的运用，可以大致分为三个方面：①在试验设计的制定中，有助于确定动物种系、给药剂量和频率、给药途径等。②可确定受试物的吸收程度，暴露量等。③有助于试验结果的分析评价。
检查方法
对亲代动物存活和一般状态观察至少1次/日。对出现的毒性症候，要详细观察其程度和过程。对发现死亡的动物应立即剖检，分析死亡原因。妊娠动物在给药期间每日测定体重。
关于生殖器官的病理组织学检查。通过2周以上的重复给药毒性试验而未见影响，也未见一般生殖毒性试验中对受孕率的影响，可不进行特殊的检查。但当发现对受孕率有影响时，必须选用适当的方法进行精确检查。可根据需要进行精子检查，可检出生殖器官病理组织学方法难以检出的精子变化。
结果分析
采用适当的统计学方法进行结果分析评价。对胎仔和哺乳期幼仔试验结果进行统计学分析的时候，一般是以窝单位。应注意与同期阴性对照和历史对照的比较。结果分析出现困难的时候，实施追加试验非常重要。当发现动物有畸形发育和其他不良影响时，在确认剂量反应关系和无毒性剂量的同时，还必须对其作用机制进行探究，就其对人的危险性作详细的考察。可分别推定对亲代动物和对子代动物的无毒性剂量。对亲代的毒性影响包括一般毒性影响（一般状态、体重、摄食量、解剖所见等）和对生殖的影响（受孕率、妊娠时间、分娩、哺育等）；对子代动物的影响则为对其发育（胎生期死亡、发育迟滞、畸形、出生后生长发育障碍等）的影响。

参考文献：生殖发生毒性试验。见：日本临床前研究指导原则解说。药事日报社，2002：49-62
【致谢】彭双清教授和王秀文教授分别提供了日本2002版及上一版指导原则的中文译文。对他们的辛苦工作致以衷心的感谢！