Vero细胞疫苗中宿主细胞蛋白（HCP）检测研究简介

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2004-07-09

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Vero细胞疫苗中宿主细胞蛋白（HCP）检测研究简介
生物制品组田博
Vero细胞HCP是指疫苗中来源于宿主细胞的蛋白成分，其主要成分包括：宿主细胞结构蛋白和转化蛋白（细胞分泌的促生长蛋白），前者的危险性在于引起机体过敏反应，后者的潜在危险性在于引起细胞转化。以Vero细胞为基质细胞生产疫苗的过程是将病毒接种于Vero细胞，病毒利用细胞环境复制自身，同时导致宿主细胞结构受损、死亡，释放大量的宿主细胞结构蛋白于疫苗中，这部分蛋白有可能成为疫苗中的过敏原；Vero细胞生长的同时向培养液中释放生长因子等促生长蛋白，可引起细胞增殖和分化，Vero细胞结构蛋白和促生长蛋白构成宿主细胞蛋白（以下简称HCP）。
目前，CHO细胞与Vero细胞被WHO和我国药品监督管理局认可，用于生物制品的生产的传代细胞。Vero细胞（一种非洲绿猴肾的传代细胞系）是一种理想的疫苗生产基质：遗传背景清楚，核型稳定，无外源因子污染，160代以内没有致瘤性，适合大规模培养，可用生物反应器生产，保证了疫苗大批量细胞的均质性和安全性。
Vero细胞已经用于疫苗的生产：80年代法国率先使用Vero细胞生产脊髓灰质炎疫苗和狂犬病疫苗, 一亿二千万人份人群接种的结果证明Vero细胞作为疫苗的细胞基质是安全和有效的。1994年维尔博狂犬病疫苗进入我国并投放市场。目前，我国已正式生产Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗。其它正在开发、研究和生产的疫苗有流感疫苗、出血热疫苗、甲肝疫苗、轮状病毒疫苗、SARS疫苗等等。
WHO推荐使用Vero细胞生产疫苗：WHO于1987和1998年分别组织制定了《使用传代细胞生产生物制品规程》和《使用动物细胞生产生物制品规程》。在前者中提出：使用传代细胞生产生物制品，必须经过纯化，疫苗中残余DNA不得超过10ng/剂量，去除疫苗中毒性蛋白，但对 HCP残留量没有提出明确要求。但在后者中已对传代细胞的HCP残留量提出了指导性要求，即将传代细胞HCP含量降低至可接受水平。表明WHO 已开始关注HCP的含量及其对于疫苗安全性的影响，需要加强探索性研究。
疫苗中的HCP可成为疫苗的过敏原：有研究报道提示，通过豚鼠皮肤被动转移试验证明地鼠肾细胞可引起豚鼠过敏反应；浓缩的地鼠肾细胞狂犬病疫苗过敏反应的发生可能与疫苗中地鼠肾细胞成分增多有关。也有研究表明，地鼠肾细胞乙脑疫苗的过敏反应可能与疫苗中地鼠肾细胞蛋白含量高有关。但少见有关HCP检测方法以及在疫苗中基本安全限量方面的研究报道。
新近，为了弄清Vero细胞HCP是否引起过敏反应及可能的最低剂量，有研究者采用Vero细胞培养的无牛血清、无人白上清制备了二批Vero细胞HCP抗原，一批用于免疫动物制备免疫血清，另一批用作酶标试验的标准品和免疫原性试验的样品。用Vero细胞反复冻融的方法制备了一批Vero细胞裂解蛋白，用于豚鼠过敏原性试验的比较。
结果表明Vero细胞裂解蛋白和Vero细胞HCP均可成为过敏原，引起豚鼠过敏反应；过敏反应的强度和过敏原的剂量呈正相关；当Vero细胞裂解蛋白和Vero细胞HCP降低至50ng/只以下时，没观察到任何过敏反应的症状。因此，提示疫苗中Vero细胞HCP具有过敏原性，其含量应限定小于50ng/ml。
为了定性分析Vero细胞疫苗生产过程中HCP含量的变化，采用SDS-PAGE和Western Blot法分析了Vero细胞疫苗生产过程中HCP含量的变化，结果表明目前一些纯化苗中含有一定量的HCP。因此，应对成品苗中的Vero细胞HCP进行限量。
通过对包被液、封闭液、抗体工作浓度及相应的的工作条件的优化，建立了间接ELISA法相对定量检测Vero细胞 HCP的方法，检测的线性范围为31.25ng/ml~500ng/ml。利用所建立的ELISA方法，对Vero细胞乙脑疫苗生产过程的中间产品进行了Vero细胞HCP的测定, 生产过程中Vero细胞HCP的总去除率达到99%以上, 由此推算成品苗中HCP的含量可降低到9.125——47.5ng/剂。
上述初步研究结果表明：疫苗中Vero细胞HCP的含量多少可能与豚鼠过敏反应的发生具有正相关性，因此疫苗生产企业在研制Vero细胞疫苗时应对疫苗中Vero细胞HCP残余量给予关注，结合有关安全性试验，研究并制定合理的HCP的内部质控标准，将有利于企业提高产品质量，减少疫苗副反应的发生率；可以通过酶联等方法，尝试建立相对定量检测Vero细胞HCP含量的质控方法。
类别:审评二部

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