β-内酰胺类抗生素高分子杂质及分析方法

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2005-09-12

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审评三部霍秀敏

摘要：本文简要介绍了高分子杂质的定义、来源和分类，使读者对β-内酰胺类抗生素高分子杂质有一个全面的了解；阐述了高分子杂质的分析方法，对凝胶色谱-自身对照外标法定量的原理和方法验证的主要内容进行了详细的说明，供注册申请人和业内人士在进行高分子杂质质量控制研究时参考。
关键词：β-内酰胺类抗生素，高分子杂质，分析方法。

β-内酰胺类抗生素（β-lactam antibiotics）系指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，包括临床最常用的青霉素（penicillins）与头孢菌素（cephalosporin），以及近年开发的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。一般来说，该类抗生素较为安全，不良反应少，但对特异体质的患者也可发生致命性的不良反应，如过敏性休克，致使此类药物在临床的应用中受到限制。本文介绍了β-内酰胺类抗生素高分子杂质的定义、来源、分类和分析方法，详细地阐述了凝胶色谱-自身对照外标法定量的原理和方法验证的主要内容，供注册申请人和业内人士在进行高分子杂质质量控制研究时参考。
一、β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质
1、高分子杂质的定义
高分子杂质系指药物中分子量大于药物本身的杂质的总称。分子量一般在1000～5000道尔顿，个别可至10000道尔顿。
2、高分子杂质的来源
β-内酰胺类抗生素高分子杂质有外源性和内源性两种。外源性一般源于发酵工艺，为蛋白、多肽、多糖等杂质与抗生素结合的杂质。内源性系指抗生素药物自身聚合的产物。聚合物既可来自生产过程，又可在贮藏过程中形成，甚至在用药时也可以产生。如阿莫西林颗粒在采用开水冲服时，其高分子杂质可增加100倍。
随着现代生产工艺的不断改进和提高，目前产品中外源性杂质日趋减少，对内源性聚合物的控制是当前抗生素药物高分子杂质控制的重点。
3、高分子杂质的分类
β-内酰胺类抗生素主要包括青霉素和头孢菌素两大类，除青霉素G和V外，临床中常用的β-内酰胺类抗生素均为半合成抗生素，故除青霉素G和V中还含有少量的青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽外，其他产品中的高分子杂质主要是聚合物。
（1）青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽
青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽的分子量在3500—2400道尔顿左右, 由青霉素的β-内酰胺环和多肽上的伯氨基按亲核反应机理缩合而成，主要在发酵工艺中形成。
高pH环境有利于缩合反应的进行；样品在贮藏过程中，多肽类杂质残留的自由氨基仍能和β-内酰胺环反应，直至被饱和；反应速度与样品本身水分含量和贮藏温度有关，青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽的性质比较稳定。
（2）青霉素聚合物
青霉素的聚合反应有两种方式：一种是一分子青霉素的母核开环，形成活性位点，与另一分子青霉素母环上的活性基团聚合，侧链上的活性基团不参与反应。另一种是一分子青霉素的母核开环，形成活性位点，与侧链上的活性基团聚合。对侧链不含氨基等活泼基团的青霉素，聚合反应只按一种方式进行；对氨苄青霉素等侧链含有氨基的青霉素，聚合反应可按两种方式进行。
（3）头孢菌素聚合物
头孢菌素的聚合反应亦有两种方式：一种是只发生于母核的N型聚合反应，另一种是侧链参与的L型聚合反应。
对于7位侧链中不含自由氨基的头孢菌素，如头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等只能发生N型聚合反应。7位侧链中有自由氨基的头孢菌素（如头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻肟等），在酸性条件下，氨基主要以季铵盐的形式存在，一般只发生N型聚合反应。在碱性条件下，N型和L型聚合反应均可以发生。N型和L型聚合反应的相对强度由化合物的结构决定。如头孢曲松、头孢他啶等侧链的自由氨基应可直接与噻唑环连接，但由于共轭效应的存在使得自由氨基的亲核攻击能力大大减弱，故产品中的聚合物主要为N型聚合物。
二、β-内酰胺类抗生素高分子杂质的分析方法
高分子杂质的分析方法主要有：反相色谱法、离子交换色谱法和凝胶色谱法（分子排阻色谱法）。由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（过敏性），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。因此，根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法则具有明显的优势。
凝胶色谱法（分子排阻色谱法）是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术。药物分子进入凝胶孔径内部，而高分子杂质则被排阻在外，在色谱过程中不被保留，最早被洗脱出来，保留时间较短，而药物被保留，保留时间较长。凝胶色谱法是按分子大小依次被洗脱。
根据β-内酰胺类抗生素和其高分子杂质的分子量，比较了数种凝胶介质，最后选用Sephadex G-10 作为β-内酰胺类抗生素高分子杂质分离色谱系统的凝胶介质，Sephadex G-10排阻分子量在1000道尔顿左右。
凝胶色谱方法验证的内容主要有：系统适用性试验（理论塔板数和拖尾因子）、分离度、对照溶液的线性、对照溶液的精密度（RSD）、最低检测限与定量限、F值的重现性、聚合物测定结果的重现性等。
β-内酰胺类抗生素的高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性，故无法制备对照品，不能采用对照品法定量。中国药品生物制品检定所金少鸿教授等，根据β-内酰胺类抗生素在不同离子强度的介质中具有不同表现状态的性质，首次建立了凝胶色谱自身对照外标法定量测定β-内酰胺类抗生素中的聚合物。此方法已经载入《中国药典》2000年版和2005年版，用于国产β-内酰胺类抗生素的质量控制，并已被国内外β-内酰胺类抗生素生产厂家广泛使用。
实验证明，在以水，0.01%SDS或0.5%葡萄糖溶液作为流动相时，β-内酰胺类抗生素可缔合形成表观分子量较大的缔合物，该缔合物在Sephadex G 10 凝胶色谱系统中的色谱行为与高分子杂质一样，表现为单一的色谱峰。利用这一特点，在Sephadex G 10 凝胶色谱系统中制定了新的定量方法-----自身对照外标法。
高分子杂质的检查方法通常参照中国药典的方法，重点考察系统适用性，并要进行方法验证，这一点对新药尤为重要，对注册分类6的药品，方法验证工作可以适当简化。