药理毒理审评中病理学检查的常见问题及建议

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2005-11-27

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审评四部审评七室刘兆华

病理学（pathology）是研究疾病的发生发展一般规律的一门学科，他回答了疾病为什么会发生（病因学）？致病因子是怎样引起疾病发生的（发生机制）？以及病理状态下机体形态、机能和代谢发生的变化（病理变化）和疾病最终的结局（转归）。现在我国病理学基本分为人体病理学和实验病理学。人体病理学主要任务是明确临床上遇到疾病的最终诊断，尤其是对于肿瘤的确诊，病理诊断被誉为疾病诊断的“金标准”。实验病理学则利用试验手段主要通过动物试验来阐明疾病的发生和发展。随着时代的发展，病理学逐渐和其他学科相融合，产生一些交叉学科，如环境病理学，分子病理学等。毒性病理学就是其中一门新兴学科，它是药物毒理学研究和病理学的发展相结合的产物，属于实验病理学的范畴。
众所周知，药物作为一个特殊的商品，其最突出的特点是安全、有效、质量可控。也就是说安全性评价是药品评价的核心内容之一，占据非常重要的地位。其中病理学检查所提供的信息由于客观、直观、资料和结果可长期保存，对于评价药物的安全性是必不可少的。毒性靶器官的确定、病变性质的认识、病变程度和范围的大小以及病变是否可逆的判断等都离不开病理诊断，毒性研究，尤其是重复给药的毒性研究的绝大多数数据来源于病理学检查，然而病理学检查却是耗时、费力的一项工作。国外很早就在新药的研发过程中引入了病理学。我国现在这门学科虽有所发展，但由于起步较晚，受过专业训练的人员较少，技术设备的限制等原因，总体来讲这门学科在我国还非常薄弱。所幸近年来人们已经逐渐认同病理学检查在药物研发和评价中的核心作用，渐渐开始重视毒性病理学的研究，而且我国的法规和指导原则也加强了对病理学检查的要求。同时，我们必须认识到现有的规范和指导原则要求与国际上还存有差距，但就是这样的要求，有些申报资料中也没有很好的完成，以下就药品申报资料中病理学检查存在的问题加以探讨：
一、病理学技术方面的问题。
准确、客观的病理诊断离不开优良的病理切片。常规HE制片是应用最广的病理制片技术。制作一张切片经过动物解剖、组织固定、取材、脱水、包埋、切片、染色等环节，大约80多个步骤，每一步操作不当均有可能影响切片质量。现在申报资料中所提供的照片几乎全部是HE染色切片摄制的。从提供的照片和病理报告看存有以下问题：
1、病理切片质量不合格，不能作出有效的诊断。如一般切片的厚度为3－5μm，有的单位切的太厚根本看不出组织结构或者切片染色差、切片上的组织皱褶、破碎严重。这主要是由于病理切片制作人员没有受过专门的病理技术培训或组织处理过程不当所致。比如脑组织和心肌组织致密程度不同，制片时固定、脱水的时间、温度的高低要求不一样，如果把二者放在一块处理，则不容易制作出合格的切片。其次，有些单位为降低成本，在制作过程中长期不更换液体、一次性切片刀使用时间太长，也会影响切片的质量。
另外，据笔者所知，现在我国绝大部分药物非临床安全性研究机构没有自己的病理检查室和专业病理人员，病理制片和诊断均是委托医院进行的，但由于动物组织较嫩，用临床上处理人组织的程序处理动物组织，往往不能制作出合格的切片。
2、没有遵循解剖、固定、取材包埋的一般原则。比如：病理取材一般遵循以下原则“如肉眼有病变时，所取组织一定要包括病变组织和病变周围的组织；肉眼未见病变时，则所有动物的相同脏器取材的部位要相对固定位置”。仅取病变组织没有周围的组织时，不易表明病变对周围组织的影响。同时，相同脏器的不同部位的组织学图像有很大的差别。以肾脏为例，靠近肾被膜的皮质和靠近肾盂的髓质结构明显不同，若取材部位不固定，则可能这只动物主要取的是皮质，另一只动物则取的主要是髓质，这样他们之间就缺乏可比性。取材需要遵循的另一个原则“最大面原则”，要求尽可能的展现组织的全层结构关系，反应到照片上，应该是低倍镜以观察组织结构为主，高倍镜观察细胞结构。事实上，有好多资料中提供的照片由于取材不完整或取材数量太少不能从中获得病理学的基本信息，这一部分原因与病理从业人员的素质有关，另一方面也可能与设备有关，如推拉式切片机比轮旋式切片机更容易制作大面积的切片。
3、病理学检查的组织脏器太少，仅做心、肝、肾、脑等组织器官，没有按规范的要求完成脏器的取材，或一些小的组织丢失，如垂体、肾上腺等脏器固定时不用纸包好。
4、新技术新方法的应用不多。近50年来病理技术飞速发展，免疫组织化学技术、分子生物学技术、电镜技术、流式细胞仪技术等快速发展，国外药物的研发过程中，尤其是药效学研究均有较多的使用，但是现在我国药物研发中的病理学检查几乎全部仅用HE等常规技术。这极大的制约着我们对药物的认识。例如：笔者在从事某药品的毒性研究时发现肾上腺皮质细胞出现大小不一的空泡，认为药物的靶器官可能为肾上腺，病变性质为空泡变性，但是空泡变性只是一个形态学诊断名词，不能发映病变的性质，因为脂肪沉积、磷脂沉积、细胞水样变性或者细胞吞饮血浆内物质，均可表现为空泡。这时只常规技术不能解答这个问题，可以做些特染，如苏丹III染色，空泡染成黄色时则证明为脂质沉积，属于脂肪变性。这样的诊断可能对临床的指导意义要更大一些。
二、病理学诊断方面的问题。
病理诊断需要综合大体检查和组织学检查的结果，并且要结合动物的临床症状、血液、生化等检查的结果才能最终得出，这提示毒性病理学是一门专属性很强的学科，现在我国从事毒性病理学诊断的人员很少，诊断水平有限，所能参考的资料几乎没有，并且动物的背景数据奇缺，这些均限制了病理学检查在药物研发和评价中的核心作用。
1、缺乏完善的病理学评价体系。我们知道临床病理现在已经形成了完整的诊断标准，这样不同人的诊断基本有法可依，如肝细胞坏死到什么程度定为轻度坏死，什么程度判断为重度坏死。毒性病理学现在没有一致的诊断标准，这就导致同样的病变，不同人可能得出不同的结论；而不同人得出的重度肝坏死其意义可能不一样，这必然会影响其对临床的指导意义。其次是，专业术语不规范，如有的资料描述肝细胞溶解坏死为“局部肝细胞不见”，影响交流和评价。
2 、普遍缺乏大体病理描述内容。动物解剖时，没对组织脏器进行详细的肉眼观察，这样取材时没有目的性。
3 、不能抓住主要病变。没有把动物看成是一个有机的整体作出综合评估，未能辨认出那些变化是药物直接引起的，那些病变是继发性的改变，认为出现的病理变化都是同等重要的，不能抓住矛盾的方面。
4 、把操作过程的人工假相错当病变。如处死动物不规范，动物临死前惊恐，通气过度，有可能产生肺气肿的表现，很容易把此改变错认为是药物引起的，形成药物的毒性靶器官是肺脏的错误结论。另外把组织固定时间过长出现的甲醛结晶错认为是色素沉积也时有发生。
5、未能把握人体病理学和毒性病理学的区别。前面已经提到，由于专门从事毒性病理学的人员很少，大部分单位把病理学工作委托给医院病理科。即使现在从事毒性病理学工作的人员也多有临床病理的背景。这就要求诊断人员必须充分认识到二者的不同之处。例如由于种属问题，大鼠正常脾脏内就含有一定数量的巨核细胞，而人脾脏假如出现这种细胞则为病变。另外，临床人体病理是在出现疾病的情况下分析寻找引起疾病的原因，以便指导临床治疗。毒性病理学则是在知道致病原因（高剂量给药）的情况下，发现可能潜在造成的损害。因此思考问题方法不尽相同。如肺脏出现水肿，人体病理学主要分析引起水肿的原因是什么，临床上用什么方法可以治疗它；而毒性病理学则侧重于判断出现的水肿是否与药物有关，药物为何会引起肺水肿。
三、病理资料的整理
1、没有提供病理负责人签字盖章的病理报告。由于病理切片、蜡块和湿标本可以多年保存，这就为资料的积累和学术的交流提供了条件，也为国家执法提供了依据。缺乏签字盖章的病理报告的毒性报告不能为以后的交流和核实提供帮助，因此不是一份完整的研究报告。
2 、提供的照片和报告文字描述不一致。如在血管刺激性性试验中，文字描述组织结构正常，对血管没有刺激性，但所提供的照片却明显有出血现象。相反一些描述有病变的组织，提供的照片却是正常的，更有甚者提供的照片中没有血管或者把动脉血管当作静脉。
3 、只罗列结果，不进行评价分析。不提供动物的病理变化与人体的关联性，未能体现出毒性病理学用于评价药品临床安全、有效性的目标，即风险认识、风险评价和风险控制。
4、人为割裂病理检查和血生化、血液学检查结果之间的联系。
5、人为忽略一些自认为是自发性病变的异常，或者有意隐瞒不报发现的毒性问题。未提供给审评人员足够的信息，以解除其对安全性的担忧。
四、一些建议
1、建立符合GLP规范的临床前安全性评价机构，并严格执行GLP规范。毒性病理学工作要在GLP框架下进行。
2、加强专业人员培训和交流、积极积累实验动物背景数据。
3、借鉴临床病理的资格认证经验，提高毒性病理学工作准入门槛，改善病理报告质量。
4、加强对毒性病理学研究机构的现场检查，妥善保存病理学蜡块、切片、湿标本等原始资料，杜绝弄虚作假现象。