无菌制剂的灭菌方法和灭菌工艺的验证

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2005-10-14

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审评三部霍秀敏

摘要：本文主要针对目前申报的无菌制剂工艺中存在的问题，调研了有关的文献资料，较详细地介绍了无菌制剂的灭菌工艺和灭菌工艺的验证方法，目的是提请注册申请人根据研制产品的剂型特点、微生物的情况和主成分的性质，选择合适的灭菌方法，并对灭菌工艺进行验证，以确保产品达到无菌要求。
关键词：无菌制剂，灭菌方法，灭菌工艺的验证。

无菌制剂应具有无菌、无微生物污染的特性。无菌制剂主要包括注射剂、眼用制剂、植入剂、用于伤口或手术后切口的冲洗液和透析液等。因为它们直接与身体内易发生感染的体液或组织接触，故这些制剂中无菌是最重要的质量指标。
无菌制剂的制备工艺过程中最重要的步骤就是灭菌。全部地杀灭或除去细菌，通常称为灭菌。常用的灭菌方法主要有以下5种：1、蒸汽法；2、干热法；3、过滤法；4、环氧乙烷法；5、辐射法。选择哪种方法进行灭菌，主要考虑制剂的特点、微生物的情况和主成分的性质（化学稳定性、热稳定性等），但不管采用哪种方法，产品必须要经过无菌检查以证明所采用方法的效果，同时还要对灭菌方法进行验证。
笔者在审评过程中发现，个别无菌制剂申报资料中制备工艺部分选择灭菌方法比较随意，没有考虑制剂的特点、微生物的情况和主成分的性质。例如，对耐热的注射液，在没有考察主辅料中存在的微生物的情况下，直接选择过滤灭菌法。另外，湿热灭菌温度的确定仅依据主药的稳定性，未考虑剂型选择的合理性和灭菌的效果，这种现象在粉针改小水针、小水针改大输液中比较明显。实际上，剂型的选择、制备工艺的研究和验证，以及拟达到的制剂的质量指标之间是相互关联的，如果不能达到拟定的制剂的质量指标，则应该考虑剂型选择的合理性和制备工艺的可行性。下面就常用的灭菌方法和如何进行灭菌工艺的验证做一简要的介绍，目的是与有关同仁进行交流和探讨，共同提高对灭菌方法和灭菌验证工作的认识。
一、常用的灭菌方法
1、蒸汽法：是在高压灭菌器中使用高压蒸汽进行灭菌的方法。因微生物在湿热的环境中，一些重要的蛋白发生变性和凝固，使微生物死亡，从而达到灭菌的目的。较之干热灭菌，在湿热的条件下，微生物可在相对较低的温度下被杀死。高压灭菌器的常规操作温度是121℃，时间是20分钟；也可选择达到相同杀灭效果的115℃，30分钟。一般来说，湿热灭菌方法适用于可承受所需温度，且能被湿气穿透但不会受到不良影响的、包装在密闭容器中的药物制剂。蒸汽灭菌对油类、脂肪类、油性制剂、其他不能被湿气穿透的制剂，以及可能会被凝结水破坏的粉末无效。
2、干热法：是在特别设计的灭菌炉中进行灭菌的方法，通过气体或电加热，炉内温度可控。干热灭菌是基于焚化或氧化使微生物脱水死亡，从而达到灭菌的目的。因干热灭菌在杀灭微生物方面的效果较差，故需要更高的温度和更长的时间。具体的温度和时间需根据制剂的大小和类型、容器及其热分布特性来确定。一般来说，进行灭菌处理的个体单位应尽量小，装载灭菌炉时热空气应能在炉内容器室内自由循环。干热灭菌的温度通常是160℃至170℃，时间不少于2小时。更高的温度可缩短时间，反之，较低的温度则需要更长的时间。干热灭菌通常用于湿热灭菌无效的物质，包括不挥发油、甘油及各种热稳定的粉末等。干热灭菌也是玻璃器皿和手术器具灭菌的有效方法。
3、过滤法：是通过过滤介质吸附或筛除去除微生物的方法。一般用于热敏感溶液的灭菌。但是，采用过滤灭菌方法的制剂必须要进行严格的无菌检查和验证，因为制剂过滤灭菌的有效性主要取决于被滤溶液中存在的微生物。所以要根据被滤溶液中存在的微生物情况，选择适宜孔径的滤膜。
4、环氧乙烷法：环氧乙烷（EO C2H4O）是最常用的气体灭菌剂。其是通过与细胞内的大分子起化学反应而破坏和消除蛋白的活性，使微生物死亡，达到灭菌的目的。通常用于热敏感和湿敏感的物质。气体灭菌的设备与高压灭菌的设备类似，蒸汽高压灭菌器与环氧乙烷灭菌器联用的装置已经上市。气体灭菌法的可变因素较多，如温度（27℃～63℃，通常在38℃～54℃之间）、气体的浓度（300mg/ml～1200mg/ml，通常在400mg/ml～600mg/ml之间）、湿度（RH30%～90%，通常在RH 50%～60%之间）和时间，故较之蒸汽灭菌法和干热灭菌法，气体灭菌法不能严格定量。一般来说，增加系统的相对湿度和温度可以增强气体灭菌的效果，并可缩短时间。如果被灭菌物质不能承受增加的湿度和温度，则需要延长时间。通常环氧乙烷气体灭菌的时间为4至16个小时。因为环氧乙烷气体具有较强的穿透能力，常用于医疗器械、外科手术用具和一次性塑料注射器等的灭菌；还可用于不与气体发生化学反应的不稳定的酶制剂、抗生素和其他药物的灭菌。
5、辐射法：是使用γ射线或阴极射线灭菌的方法。可能是基于通过射线照射后，微生物中的化学物质（DNA）发生了变化，使细胞活性丧失，从而达到灭菌的目的。通常剂量 1.5Mrad。辐射灭菌可对某些药物制剂进行灭菌，但需要非常特殊的设备，因此在实际的应用过程中受到限制。
上述灭菌方法中应用和研究最广泛的是加热法，加热灭菌是以完全杀灭细菌为特征的手段，也是通常选用的方法。
二、灭菌工艺的验证
所有灭菌工艺的验证都要经过以下四个步骤，1、选择能抵抗灭菌工艺的生物指示剂；2、考察各种变量对生物指示剂耐受性的影响（例如，生物指示剂的繁殖，生物指示剂与被灭菌物质之间的相互影响）；3、建立生物指示剂在灭菌过程中破坏的定量指标；4、测定被灭菌物质在特定工艺条件下实现无菌的可能性。
生物指示剂应具有如下特性：1、对灭菌方法具有耐受性；2、耐受性在设定的条件下稳定且可重复；3、灭菌工艺后可有效回收；4、非致病性。
实际上，每一种灭菌工艺都经过具有上述特征的细菌的验证，除过滤法外，常规使用的生物指示剂是孢子，因为在不利的环境中，孢子比一般细菌的生存能力强。湿热、干热、环氧乙烷和辐射灭菌都用革兰阳性菌的孢子做生物指示剂，过滤灭菌用革兰阴性小棒状杆菌做生物指示剂。
下表列出灭菌方法和相应的生物指示剂：

选择了合适的生物指示剂，灭菌方法的有效性就可以用生物指示剂的去除来表示。
灭菌研究的基本工具就是存活曲线，它是通过绘制存活的生物指示剂的数量得到，该数量是设定灭菌方法的某些参数的指数函数。加热灭菌和环氧乙烷灭菌的存活曲线，生物指示剂的存活数是在固定灭菌条件下（加热灭菌是温度，环氧乙烷灭菌是气体、温度和相对湿度的共同作用）暴露时间的函数。辐射灭菌的存活曲线，生物指示剂的存活数是辐射剂量（剂量单位是rad 或Mrad）的函数。用标准微生物技术（平板计数法）定量测定灭菌过程不同时间区间存活的生物指示剂数，以时间为横坐标绘制存活曲线。从存活曲线上可以计算出灭菌耐受性的D值，也就是存活曲线的斜率。D值是将细菌的总量减少一个数量级所需的时间（加热灭菌和环氧乙烷灭菌）或剂量（辐射灭菌）。
下表列出一些不同灭菌工艺的D值：

如果D值为2分钟，要将细菌数减少6个数量级，总的暴露时间应为12分钟。但通常灭菌方法是通过过度杀灭来验证的（细菌数减少12个数量级），故总的暴露时间应为24分钟。
过滤灭菌法生物指示剂的去除用过滤器的除菌效率（LRV）表示，LRV是在标准的生物指示剂数量（107个菌/cm2过滤面积）和过滤条件下测定的。
灭菌工艺是保证无菌制剂达到无菌要求的关键步骤，注册申请人应根据研制产品的剂型特点、微生物的情况和主成分的性质（化学稳定性、热稳定性等），选择合适的灭菌方法，且所选灭菌工艺是经过验证的。如所选灭菌工艺为非常规灭菌工艺，不仅要经过无菌检查以证明所采用工艺的效果，还应对灭菌工艺进行验证，以确保产品达到无菌要求。

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