微生物限度检查法方法验证中应关注的几个方面

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2006-05-30

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审评三部王伟萍霍秀敏

摘要：本文就注册申请人提供的微生物限度检查法方法验证资料中存在的问题，重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证，以及在整理微生物检查方法验证资料时应关注的几个方面，以使验证内容完整，有利于评价者对方法的可行性做出判断。
关键词：微生物限度检查法，方法验证。

2005版中国药典微生物限度检查法增加了方法验证的内容，这一要求完善了微生物限度检查研究的内容，因为方法验证是方法研究的重要内容，只有通过方法验证证明可行的方法方可用于相应项目的检测。
目前，注册申请人提供的微生物限度检查法方法验证的内容过于简略，有的设计不够严谨，有的过程不够规范，或者未进行方法验证等，还有的虽进行了方法验证，但验证的重点不突出，不能反映试验方法的完整性和可行性。
实际上，微生物限度检查主要是考察待测物受微生物污染的程度，检查内容包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查，方法验证就应针对细菌、霉菌、酵母菌计数方法和控制菌的检查方法进行验证。
下面就分别介绍细菌、霉菌、酵母菌计数方法验证和控制菌检查方法验证的内容。
一、细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证内容
该验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。验证菌株为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌，菌种要求不得超过5代，菌液制备为50－100cfu/ml。验证方法分试验组、菌液组、稀释剂对照组、供试品对照组，具体方法如下：
1、试验组：
1）平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
2）薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。
2、菌液组：测定所加的试验菌数。
3、稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
4、供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
5、结果判断指标：计算供试品组的菌回收率、稀释剂对照组的菌回收率。
1）在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。
2）若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，按此该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。
3）若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。
二、控制菌检查法的验证内容
控制菌检查包括大肠菌群、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、铜绿假单胞菌和梭菌检查。试验菌株按规定检查的控制菌选择相应的验证菌株，大肠菌群检查用大肠埃希菌，梭菌检查用生孢梭菌。验证大肠埃希菌、大肠菌群和沙门菌时的阴性对照菌株为金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和梭菌时用大肠埃希菌。菌种要求不得超过5代。菌液制备为10～100cfu/ml。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行，验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行，具体方法如下：
1、试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。
2、阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组。
3、结果判断：阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。
在整理微生物检查方法验证资料时还应明确：1、环境：是否动态测定洁净度，应列出数据；2、活菌计数：各菌液浓度是否在要求的范围内（列出数据）；3、具体操作方法：①细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证：列表说明各菌株的代数、阳性菌数、样品＋阳性菌数、样品本底、回收率；②控制菌检查法的验证：列表说明试验项目、各菌株的代数、培养时间、试验组结果、阴性菌对照组结果；以使验证内容完整，有利于评价者对方法的可行性做出判断。
以上是我们对微生物检查法方法验证方面的一些认识，不当之处请多指正。