制备注射用脂质体的磷脂的技术要求

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2006-11-13

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张明平
审评四部七室

【前言】
脂质体(Liposomes) 是将药物包封入类脂质双分子层中而形成的一种超微型球状载体。作为药物载体使用的脂质体其成膜材料主要是一些天然或合成的脂质(磷脂和固醇等) 【1】 ,常用的天然膜材有卵磷脂(Lecithin ,Egg phospholipid) 、豆磷脂、胆固醇、角甾醇等,合成膜材有二肉豆蔻酰卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油等。影响脂质体膜稳定性的重要因素中，主要与磷脂相关的性质为“相变温度”和“电荷”，主要与工艺有关的是“粒径”；以及所载药物的物理和化学特性，外界温度、所处环境pH 、离子强度等。本文通过分析注射用脂质体的理化性质，提出了注射用磷脂的一些质控要点。

【磷脂概况】
磷脂作为构成脂质体的基本材料，对脂质体的理化性质有决定性的影响。磷脂是含磷酸根的脂类物质的总称【2】【3】。按结构可分为含甘油的甘油磷脂和含鞘氨醇的鞘磷脂两大类。鞘磷脂（SM）的分子结构中有酰胺键，在双分子膜中能形成氢键带，使形成的脂质体更加稳定，故国外脂质体产品的趋势是使用鞘磷脂代替甘油磷脂。但目前国内尚未有药用鞘磷脂产品上市。

甘油磷脂通常也称为“卵磷脂”（Lecithin），最早（1850年）用于命名从蛋黄中分离得到的一种物质（实际上不是单一成分）；因此，“卵磷脂”（Lecithin）是一个多义词，广义为磷脂的俗称，也可作为大豆磷脂的俗称，其成分可能包括有磷脂酰胆碱(PC) 、脑磷脂(PE) 、肌醇磷脂(PI) 、丝氨酸磷脂(PS)、甘油（PG）和磷脂酸( PA) 等。其狭义只指磷脂酰胆碱。其结构式如下图所示。

图1、磷脂结构示意图【4】
由图可见分子中在甘油桥中1－C和2－C与一对疏水的脂肪链经酯键连接。天然来源的PC的两条脂肪链在长度和饱和度上是不同的。通常植物来源的磷脂含较多不饱和脂肪酸，易被氧化；动物来源的磷脂饱和脂肪酸含量较高，不易氧化；且磷脂中的PS、PG、PA均带负电荷，其余为电中性。溶血磷脂（Lyso－PC）是我们重点关注的一类具有安全性隐患的物质；它是由PC经过水解，失去两条脂肪链中的某一条得到的。

【磷脂的物理性质】
每一种磷脂都有一个从有序的胶态(固态) 转变为液晶相的温度，称为相变温度( Tc)。温度超过磷脂的Tc ,磷脂脂肪酰链伸缩、弯曲、弯扭和侧向运动加速,膜结构处于“流体态”和“液晶态”,双分子膜从原来的紧密排列状态开始紊乱,膜刚性和膜厚度降低,膜通透性增加,包封内容物渗漏加剧。因此相变温度是磷脂最重要的一个理化性质。测量相变温度的经典方法是差示扫描量热法（DSC），但要注意测量结果与升温速率有关；随着升温速率的增加，吸热峰将向高温侧移动。不同磷脂的Tc 差异很大【5】，影响磷脂Tc 的因素一般认为是磷脂分子的链长、饱和度、头部基团（亲水或亲油基团）和一些二价离子。而不同的磷脂构成, Tc 的变化也是不同的。而且由于载药脂质体是由多种成分组成,因此其相变较单一成分的磷脂复杂得多。而我们更关注的是脂质体双分子膜作为一个整体所表现出的相变温度情况。当制备脂质体时应控制温度高于Tc，以便药物进入脂质体包裹起来；而平时存储过程中，应注意保持温度低于Tc，以减少药物的泄漏。

电荷【5】也是影响脂质体包封率和稳定性的重要因素。通常与磷脂膜带有相反电荷的药物离子具有较高的包封率；而相同电荷的药物离子则包封率较低，易渗漏。而脂质体的聚集度则与其Zeta电位和电阻有关。制备脂质体的磷脂按其所带电荷不同分为负电荷(酸性) 磷脂、正电荷磷脂和中性磷脂。但同样我们关注的是脂质体双分子膜作为一个整体所表现出的电荷情况。而脂质体的相变温度和电荷除了受到磷脂的相变温度和电荷情况影响外，还受到诸如离子强度，pH，添加剂，药物性质等诸多因素的影响。因此，磷脂的相变温度和电荷虽然并不一定需要作为质控指标订入质量标准，但有必要严格的控制磷脂中的各组分的比例和质量，以保证制备的脂质体的质量的均一性。

【磷脂的化学性质】
磷脂的化学稳定性直接影响了脂质体的稳定性。主要涉及两个问题【5】：氧化和水解。制备脂质体时应用的磷脂大多为各种磷脂的混合物,其中多数含有一定量的不饱和脂肪酸。一定条件下,一些氧化物质如氧、氧化自由基等极易使磷脂分子的不饱和脂肪酸键氧化断裂;而且磷脂的氧化程度随着磷脂含有的不饱和双键的数目和脂肪酸碳链长度增加而增加。脂质过氧化过程通常是一个链锁式反应,高温、光照、不适的pH、磷脂酶类、过氧化物酶类、一些金属离子/ 次氯酸盐和氧化自由基等物质的存在是加速诱导脂质体氧化水解反应的重要因素。氧化水解反应可发生于脂质体的制备、储存和应用过程中,如在脂质体制备过程中,缓冲液的除气、温度的控制、氮气的使用等都要特别注意,这些因素都可能加速氧化水解的产生。磷脂不饱和双键氧化断裂生成的过氧化物、丙二醛、水解产生的脂肪酸及溶血卵磷脂等,可进一步水解成甘油磷酸复合物及脂肪酸等对人体都存在一定的毒性。因此应采用TLC或HPLC法检测水解产物（主要是溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺）。而在05版药典在二部附录ⅩⅨ E微囊、微球与脂质体制剂指导原则中增加了“脂质体氧化程度的检查”项[ 由于氧化偶合后的磷脂在波长230nm左右具有紫外吸收峰而有别于未氧化的磷脂。测定脂质体的卵磷脂时，其氧化指数应控制在0.2以下。具体方法是:将磷脂溶于无水乙醇配成一定浓度的澄明溶液，分别测定在波长233nm及215nm的吸光度，由公式计算氧化指数（氧化指数＝A233nm/A215nm）]。

【磷脂和脂质体的质控】
注射用磷脂的质控是为脂质体的质控服务的。磷脂的理化性质决定了在脂质体的质控指标中增加氧化指数检查项是必须的，同时出于安全性担忧，还应在质量研究和稳定性考察中增加溶血磷脂的检查项。另外非常重要的是在处方筛选和工艺研究中对双分子膜的相变温度和电荷进行研究，从根本上控制住脂质体的质量，掌握影响脂质体质量的内在决定性因素的相关信息。

注射用磷脂当前并没有一个公认的通行标准。在中国药典2005版二部附录Ⅶ H脂肪与脂肪油测定法中规定了对脂肪类物质应进行下列检查：相对密度、折光率、熔点、脂肪酸凝点、酸值、皂化值、羟值、碘值、过氧化值、杂质、水分与挥发物等。《部颁标准第六册》中收载的注射用大豆磷脂和注射用卵磷脂的质量标准基本参照了药典附录VII H的思路进行质控，含量仅测定氮和磷的量；检查项检测了碘值，酸值或皂化值；大豆磷脂的标准中还检查了丙酮不溶物；卵磷脂质量标准中检测了游离脂肪酸。综上所述，部颁标准显然不足以控制磷脂的质量以满足脂质体的质控的要求。标准中应当对磷脂中的不同组分进行控制；只有控制了磷脂内不同成分的量和比例，才能得到性质均一的磷脂双分子膜，才能得到质量均一性好的脂质体。磷脂易于氧化，因此“过氧化值”或氧化指数检查也是必不可少的；另一方面，磷脂易于水解，脱去一条脂肪链后产生的溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺等物质也必须进行限定。由于当前的药用磷脂多为分离提纯得到，因此还应当设立适当的检测项目对原料或工艺中带入的杂质进行检查，如残留有机溶剂，游离脂肪酸，甘油三酯等进行检查。值得一提的是“丙酮不溶物”（检测对象包括游离脂肪酸，甘油三酯，水等），“酸值”（检测对象包括游离脂肪酸，磷脂酰乙醇胺）等检测项所反映的产品的物理化学性质的意义不够明确，因此如质量标准中采用色谱法等手段可对各组分的含量进行比较精确的控制，在最终的质量标准中可考虑不订入这几项检查；但考虑到部颁标准的延续性，仍应对这几项进行研究，并将测定结果与部颁标准进行比较。出于安全性考虑，还应当设立细菌内毒素和无菌检查项。

【参考文献】
1、张冬青; 程怡; 脂质体的研究概况，中药新药与临床药理, 2002年 02期；P125～128。
2、温光源; 磷脂的特性和用途，粮油食品科技, 1994年 03期；P11～16。
3、候新朴、武凤兰、刘艳；《药学中的胶体化学》；化学工业出版社；2006年1月第1版。
4、李涛; 王天志; 卵磷脂的研究进展；中药材, 2002年 10期；P752～756。
5、蔡明志; 王昆; 黄复生; 载药脂质体物理化学稳定性的研究进展；国外医学.药学分册, 2005年 06期；P404～407。

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