抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析

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2007-04-23

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审评三部审评五室刘英

摘要：本文对抗生素微生物检定法中的管碟法在方法学验证中的常见问题如线性与范围中溶液浓度与直径的关系、精密度的测定方法等进行了分析，归纳其错误的问题，给出了正确的操作方法。
关键词：抗生素微生物检定法多组分抗生素方法学验证

抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素测定方法。自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于①微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗菌活性；②多组分抗生素由于结构与不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；③许多抗生素品种由于各种原因如无特征紫外吸收等，目前没有适当的化学分析方法表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期内化学分析法不可能完全取代微生物检定法。中国药典2005年版仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价，目前申报已有国家标准的该类制剂较多，在质量研究中存在诸多问题，现就常见的问题加以分析，希望对注册申请人有所帮助。
一、方法的建立
1、供试品与标准品的同质性抗生素微生物检定法的原理以供试品与标准品同质为前提，方法建立前，首先应确定供试品与标准品是否同质，包括化学结构、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响是否造成供试品与标准品不同质。
2、培养基、试验菌、缓冲液和培养条件的选择
可参照中国药典建立，在此不再赘述。
3、检定方法的确定
可采用一剂量法（标准曲线法）、二剂量法及三剂量法等。一般确定线性与范围采用一剂量法（标准曲线法），常规含量测定采用二剂量法，标准品标定采用三剂量法。
4、抗生素溶液的稳定性
选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种，若溶剂和缓冲液与其不同，应考察抗生素储备溶液和测定溶液在室温、40℃和不同pH值缓冲液中，以及放置不同时间的稳定性，以确定抗生素储备溶液和测定溶液的存放时间和条件。
二、方法的验证
验证的目的是证明采用的方法适合于检测的要求。
验证内容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度）、专属性、适用性和线性。
在申报资料中常见的错误有：线性测定不符合抗生素微生物检定法一剂量中心浓度等比测定的原理；精密度的测定方法不正确；无专属性试验。下面就方法验证的内容与常见的错误加以简述。
1、专属性考察杂质、辅料等对测定结果准确性的影响，可通过以下试验验证：
(1) 用辅料等替代抗生素进行试验，应不产生抑菌作用。
(2) 采用回收率试验进行验证，至少有9对以上数据，并进行显著性检验。
2、线性
线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。做抗生素微生物检定法试验时，被测物浓度应转换为对数浓度。
管碟法中抗生素溶液浓度的对数值与抑菌圈直径或面积之间的关系在一定的浓度范围内，应呈线性关系。用一剂量法测定。
Ⅰ、测定方法
(1)确定直线中心点的抗生素浓度。中心点浓度C 0应使所致抑菌圈的直径在16～18mm。
(2) 线性测定的剂距一般用等比级数，可选用1:0.80、1:0.85或1:0.88等，稀释成适当的浓度系列。
(3)每个浓度为一组，至少设8组，一般每组3～5个双碟，每组双碟数m应相等。
(4)管碟法的线性考察，其直线的最低浓度端与最高浓度端的确定，应选择比所致抑菌圈直径在18～22mm高的浓度为最高浓度，即高浓度应涵盖能致抑菌圈直径在18～22mm的浓度。按中心浓度等比的关系，求算最低浓度。但最低浓度端应涵盖含量（效价）测定时高、低剂量之比为4：1的低剂量浓度。
(5)取制备好底层及菌层培养基的双碟，每3～5个双碟为一组，共分n组
(6)各组滴加完毕后，将双碟在规定温度下培养一定时间，测定各抑菌圈直径。
(7)以各组浓度C的对数值log与相对应各浓度的直径与中心点浓度直径的差值作线性分析，得回归方程及相关系数r，并对相关系数作显著性检验，同时绘制线性图。
Ⅱ、常见错误
（1）直接以浓度与直径作线性关系图。
（2）虽然以抗生素溶液浓度的对数值与抑菌圈直径作线性关系图，但不是等比系列，如浓度设计为：1、2、3、4、5、6、7u/ml等。
以上两种现象显然违背抗生素微生物检定法的原理，也不可能得出直线关系。
（3）抑菌圈直径太大或太小：大于24mm或小于14mm均不正常。如：

效价测定中高浓度溶液所制的抑菌圈直径大于26mm时已超出双碟的直径范围而无法测量，低浓度溶液所制的抑菌圈直径小于14mm时，其浓度的对数剂量与直径已不成线性，而在线性研究中结果为抑菌圈直径在5mm～35mm范围内与浓度的对数剂量线性关系良好，显然上述数据是不符合实际情况的。
（4）以浓度与效价建立线性关系。如：
剂量浓度（u/ml）0.001 0.01 0.0201 0.0251 0.0402 0.0502 0.1004

该方法显然不符合抗生素微生物检定方法学中线性的含义，线性是指滴加抗生素溶液的浓度与所致抑菌圈直径或面积的关系，若以浓度与效价建立线性关系，则是利用已建立好的方法去测定含量的高低，而非对方法本身进行验证。况且由于高低剂量相差较大，低者仅为1u/ml，高者达50u/ml，也可能不在同一线性范围。
以上几种结果均不是从真实试验得到，也无法进行实际实验操作。
3、准确度（回收率％）准确度系指用该方法测定的结果与真实值接近的程度，通常用回收率（％）评价。准确度验证，可根据具体试验情况选择如下试验方法。回收率试验一般用至少9次测定结果进行评价，按标示量的80％、100％、120％分别投入已知量的被测物，分别测定3次。标示量的80％、120％的回收率可在线性范围内调整标准品的剂量，使其满足抗生素微生物检定法的要求。应报告己知加入量的回收率或测定结果平均值与真实值或认可参照值之差及其可信限。
⑴模拟回收率试验：按处方成分和比例，分别加入敷料和已知量的被测物，测定回收率。
⑵加样回收率测定：如不能得到制剂的全部组分，可先测定制剂中被测物的量后，再加入己知量的被测物，根据被测物的原含量和加入量，计算回收率。
4、精密度
Ⅰ、测定方法
⑴ 重复性试验至少用9次测定结果进行评价，如制备80％、100％、120％三个不同浓度的样品，各测定3次进行试验，其中80％和120％浓度按抗生素微生物检定法的要求，重新估计效价后进行测定，再折算测定结果。或把被测物浓度当作100％，至少测定6次的结果进行评价。
⑵ 中间精密度考察测定结果的日间差、不同分析人员之间的测定结果的差异。
Ⅱ、常见错误
以一个浓度点重复测定n次，得到n个抑菌圈直径数据，对抑菌圈直径直接进行统计分析，RSD%结果常常是小于2%。
例：浓度5u/ml，直径测定结果：16.75、17.00、16.88、16.58、17.02、16.55, RSD% = 1.2%.
由于管碟法碟间差异很大，需通过统计分析分除碟间差异才能得到含量测定结果，此种方法不但不符合抗生素微生物检定法的原理，在实验中也得不到这样的结果。正确的方法应是对不同次的效价测定结果进行统计分析。
5、耐用性适用性系指测定条件有较小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，成为该方法可用于提供常规检验的依据。如果测定条件苛刻，则应注明。管碟法主要考察不同来源及批号的培养基、培养基的pH值、缓冲液的pH值及抗生素溶液稳定性等对测定结果的影响。
由于一般均为已有国家标准的注册品种，方法较成熟，目前对抗生素微生物检定法方法学验证中耐用性进行考察的较少。