银屑病药效学模型及结果评价

银屑病

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2006-11-10

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审评三部姚治、孙涛

摘要：近来国内创新性的抗银屑病药物的申报呈上升趋势，但由于银屑病发病机制不完全清楚，现有药效学模型与临床的相关性尚存在一定问题，给研究和评价带来一定困难。本文整理总结了现有的一些抗银屑病体内外药效学模型和试验方法，并对其结果的评价价值做了一定探讨。希望对相关研究和评价提供参考。

关键词：银屑病、药效学、评价

银屑病是以表皮角质形成细胞过度增殖和分化不全、真皮浅层微血管扩张并伴有炎症反应为病理特征的表皮角化性皮肤病，其发病机制迄今尚未完全清楚。综合近年来的研究报道，关于银屑病发病的新概念认为：银屑病是多基因遗传背景下T细胞失常的免疫性疾病，表皮过度增殖与分化异常和炎症等疾病现象涉及到细胞和分子水平的异常调控，后者是指在银屑病中异常表达的免疫分子、细胞因子、炎症介质和调节分子。国外文献报导ET-1(内皮素1)、sE-selectin（可溶性选择素E）、sIL-2R（可溶性白介素2受体）、IL-6（白介素6）、IL-8（白介素8）、CD4+/CD8+等与银屑病有关。
下面简要介绍一下几种与银屑病有关的体内外药效学试验模型及结果评价：
一、体内试验
表皮细胞增殖过快和角化不全是银屑病的基本病理特点，小鼠尾部鳞片的表皮缺乏颗粒层的形成，雌激素周期的小鼠阴道上皮细胞增殖活跃，上皮细胞转换加快，均与人银屑病表皮病理特征相似。药物如能抑制小鼠阴道上皮有丝分裂和促进鼠尾颗粒层形成，就可能具有抗银屑病作用。下面两种方法是被广泛使用的较为经典的银屑病药效学模型：
1、对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响试验
雌性小鼠预先注射雌激素（如乙烯雌酚）数日，使其处于雌激素生理周期。阴道给予药物数日，末次给药后腹腔注射秋水仙碱以终止细胞分裂。取小鼠阴道组织，固定，染色，观察阴道上皮细胞的有丝分裂指数。常以甲氨蝶呤为阳性对照。
若试验结果表明药物有抑制阴道上皮细胞的有丝分裂的作用，则可提示对银屑病的疗效。
2、对小鼠尾鳞片表皮细胞生成的影响试验
取小鼠，将试验药物直接在尾部外涂给药一定时段(一般为2周)，取尾根部皮肤，固定，染色，测量鼠尾表皮厚度和颗粒形成情况。
若试验结果表明药物有促进鼠尾颗粒层形成作用，则可提示对银屑病的疗效。
3、对盐酸普奈洛尔所致豚鼠耳部皮肤银屑样皮损的影响
采用盐酸普奈洛尔乳剂型搽剂（5％）连续涂抹豚鼠两侧耳廓皮肤，每日2次，连续2周后取少量豚鼠的两侧耳廓皮肤，固定，染色，光镜观察评价造模质量。于耳廓皮肤涂抹给药，每日2次，连续2周。同法观察耳部皮肤的角化层、颗粒层、棘细胞层、基底细胞层及固有层的变化情况，并测定表皮厚度。
若试验结果表明药物有对抗模型组所致的角化层角化不完全或过度、棘细胞层变厚、表皮厚度增加等状况则可提示对银屑病的疗效。
该试验也是一种考察银屑病药效作用的有效的动物模型。
4、对小鼠血清可溶性选择素（sE-selectin）和血浆内皮素（ET-1）水平的影响。
小鼠连续给药2周后，采用合适的方法测定血清可溶性选择素（sE-selectin）和血浆内皮素（ET-1）的水平。
若试验结果表明药物具有降低血清可溶性选择素（sE-selectin）和血浆内皮素（ET-1）的水平等作用则可提示对银屑病的疗效。
有文献报道血清可溶性选择素的水平与支气管哮喘、过敏性紫癜、慢性乙肝等临床症状有一定的相关性，血浆内皮素水平也是多种病症的相关性指标，但二者与银屑病的相关性尚不十分清楚。目前国内无这方面的报道，国外对此种模型也尚处于初期研究阶段。
二、体外试验
1、对角质形成细胞增殖的影响（MTT法）
采用MTT法考察药物对于各种角质形成细胞的生长的影响，采用的细胞有人永生化表皮细胞(HaCaT细胞)、角质形成细胞（Colo-16）等。
角质形成细胞的过度增殖是银屑病主要的发病因素之一，若试验结果表明药物具有抑制角质形成细胞增殖作用则可提示对银屑病的疗效。
2、对血管内皮细胞的增殖抑制作用（MTT法）
采用MTT法考察药物对于血管内皮细胞的增殖的影响。
真皮浅层微血管扩张也是银屑病的特征性病理变化之一, 有研究认为银屑病血管变化先于表皮增生,而银屑病血管生成增加的核心是血管内皮细胞的增生。
若试验结果表明药物具有抑制血管内皮细胞增殖作用则可提示对银屑病的疗效。
3、对角质形成细胞和血管内皮细胞周期的影响
采用流式细胞仪检测方法对药物处理过的角质形成细胞（如HaCaT细胞）和血管内皮细胞（如ECV304细胞）周期进行分析。对细胞增殖能力的有抑制作用药物，其可能的用机制是阻止或延缓角质细胞从G1期到S期的过渡，或阻止于S期等抑制细胞周期的方式，导致细胞凋亡来发挥作用。
4、对角质形成细胞Cyclins/CDKs的影响
采用分子生物学的方法考察药物对角质形成细胞（HaCaT细胞）CyclinE(细胞周期蛋白)、CDK2和CDK4等细胞周期调控因子表达影响。
正常细胞的增殖和分化依赖于细胞有序的周期活动。这一活动是由细胞周期依赖性蛋白（CDK）序惯性激活和失活所控制。CDK可被细胞周期蛋白（CyclinE、D）激活，又可被CDK抑制蛋白（CKI）所抑制。文献报道，寻常型银屑病患者皮损中细胞周期蛋白依赖性蛋白CDK4表达水平较正常人皮肤高。对角质形成细胞过渡增殖有抑制作用的药物可能的作用机制是通过调节CDK4和CDK2的表达来影响细胞周期。
5、对角质形成细胞分化的影响
采用分子生物学的方法考察药物对角质形成细胞（HaCaT细胞）的转谷胺酰胺酶1（transglutaminase1，TGase1）和角蛋白6（Keratin6，KRT6）表达的影响。
角质形成细胞异常分化是银屑病主要临床特征之一，TGase1和 KRT6是表皮细胞分化的特异性标记蛋白。银屑病皮损内可见TGase1表达减少，而KRT6表达增加的情况。对角质形成细胞异常分化有抑制作用的药物可能作用的机制是通过对TGase1 mRNA表达和KRT6 mRNA表达的调节来实现的。
6、对角质形成细胞的维A酸受体RARs、RXRα及维A酸结合蛋白CRABPs表达的影响（针对维A酸类药物）
采用分子生物学的方法考察药物对角质形成细胞（HaCaT细胞）维A酸受体RARs、RXRα及维A酸结合蛋白CRABPs表达的影响。文献报道认为,维A酸药物的作用机制之一是通过与维A酸受体（RARs和RXRs）相结合而发挥活性，而细胞内维A酸结合蛋白CRABPⅡ被公认为维A酸唯一肯定的早期生物活性指标，CRABPⅡ通过直接转运维A酸至其受体来调节维A酸活性，从而促进上皮再生，抑制炎症趋化，刺激KC分化。RARα、 RARβ、 RARγ、 RXRα、 CRABPⅠ和CRABPⅡ六个基因在HaCaT细胞中均有表达，RARγ表达最高，其次为RARα、RXRα，CRABPⅡ表达水平高于CRABPⅠ，RARβ仅微弱表达，但各基因之间的表达水平没有差异。维A酸类药物可能的作用机制是通过上述途径发挥作用。
7、对角质形成细胞HaCaT细胞环氧合酶-2（COX-2）mRNA表达的影响
采用分子生物学的方法考察药物对由LPS（脂多糖）诱导的角质形成细胞HaCaT细胞环氧合酶-2（COX-2 mRNA高表达）趋势的影响。在银屑病患者外周血及皮损区可以检测到多种与炎症相关的细胞因子的表达。前列腺素E2（PGE2）是参与炎症反应的重要介质，而环氧合酶是催化花生四烯酸转化为前列腺素E2的关键酶，其诱导型同工酶COX-2是71kD的膜结合蛋白，被普遍认为与炎症反应相关。某些药物可能通过抑制炎症反应介质PGE2的生成而抑制银屑病的炎症反应症状，其可能的作用机制是通过对诱导型同工酶COX-2的影响而发挥作用。
8、对银屑病患者外周血淋巴细胞增殖的影响
有研究认为，银屑病是一种以T淋巴细胞介导自身免疫性疾病。对T淋巴细胞增殖的影响试验是较为常用的治疗银屑病药物的试验模型。
含药物培养液孵育淋巴细胞2天，测定450nm波长、参比波长650nm下OD值以考察药物对淋巴细胞增殖的影响。
若药物表现出对淋巴细胞增殖的抑制作用，可提示其具有抑制银屑病的免疫性的临床症状的作用。
9、对炎症因子及中性粒细胞趋化过程的影响
考察药物对中性粒细胞趋化细胞因子IL-8（白介素8）和MCP-3（单核细胞趋化蛋白3）的趋化性影响。银屑病皮损中有角质层下特征性的中性粒细胞聚集，是受化学趋化因子的吸引至此并被活化，活化的中性粒细胞又能影响表皮角质形成细胞的生长及分化，还能影响T细胞的活化状态，而T细胞分泌的各种细胞因子如IL-1、6、8和IFN-γ等又可影响中性粒细胞在表皮的迁移,通过生成淋巴因子影响角质形成细胞产生促炎症介质。
若药物可抑制IL-8 和MCP-3，则提示该药物可影响中性粒细胞在表皮的迁移，从而影响角质形成细胞产生促炎症介质的过程而起到抑制炎症的作用。