双层膜可以保护某些细菌免受抗生素的侵害，但是现在已经产生了可以克服这一障碍的化合物，似乎可以通过靶向外膜上的一种关键蛋白质来实现。

抗生素耐药性是一个日益严重的全球公共卫生问题。有一类细菌叫革兰氏阴性细菌特别难治，因为其细胞被双膜包膜保护着，而双层膜是抗生素的巨大屏障。当抗生素破坏细胞膜时，这些细菌通常会使用外排泵来清除药物，目前有三篇文章（《自然》第5期，第6期中的两篇，《美国国家科学院院刊》第7期中的一篇）报道了通过直接或间接靶向外膜上的一种蛋白质来克服这些障碍的抗生素。

革兰氏阴性菌的外膜中含有脂多糖(LPS)分子，外膜蛋白(OMP)横跨整个外膜。OMP被一种叫做β-桶组装机（BAM）的蛋白质复合物折叠到膜中，BamA的核心部分就是OMP本身（图1）。因为BamA暴露于细胞外空间，所以它可能是细菌屏障的致命弱点——细菌屏障抑制剂进入BamA不需要穿透细胞。事实上，一项理论验证研究表明，这种方法可以抑制OMP折叠并损害膜的完整性，尽管其机制未知。 

图1 克服双膜屏障

目前的三项研究采用了不同的方法来开发针对革兰氏阴性菌的抗生素。在第一篇文章中，Imai等人研究了革兰氏阴性细菌，这种细菌在线虫的肠道内共生，能够分泌抗生素来抵挡竞争细菌--包括其他革兰氏阴性的细菌。筛选了其中22种共生体的分泌物，对22种共生菌的分泌物进行筛选后，发现了革兰氏阴性靶向抗生素，作者将其命名为Darobactin。

在体外和在感染的小鼠中，Darobactin显示对多种革兰氏阴性菌有抗菌活性，包括对一些耐药的人类病原体，如对多粘菌素耐药的铜绿假单胞菌和对β-内酰胺耐药的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌。在有效抗生素的浓度下，Darobactin对人体细胞没有毒性。

一种新的抗生素选择性杀死革兰氏阴性病原体

接下来，Imai等人被问到Darobactin靶标的细菌分子。该小组鉴定出三种大肠杆菌菌株，它们都对Darobactin有抗药性，而且每一种菌株的bamA基因都有突变。这些突变都改变了BamA蛋白结构中同一区域的氨基酸残基，这意味着Darobactin的一个可能的结合位点可以从细胞外空间进入。

该小组研究人员还提供了证据，证明Darobactin和BamA可以通过一种叫做等温滴定量热法的技术直接结合，该技术可以测量与分子间的物理相互作用有关的热量变化。核磁共振（NMR）光谱实验的结果也与直接结合相一致，并表明抗生素能使蛋白质稳定在一种潜在的非活性构象中。

研究人员随后发现，Darobactin可以抑制离体的BAM复合物在体外执行其OMP折叠功能的能力，这与BamA直接靶向作用一致。但是，在此试验中，只有一种抗性BamA突变体显示出Darobactin的抑制作用降低。将来可以通过检测BamA突变体中是否存在darobactin–BamA结合受损的情况来确定BamA作为分子靶标。

嵌合蛋白类抗生素对抗革兰氏阴性菌

在第二篇文章中，Luther 等人将重点放在了现有抗生素murepavadin的类似物上，这种抗生素靶标的是一种名为LptD的表面暴露蛋白，该蛋白参与外膜中LPSs的组装。Murepavadin对铜绿假单胞菌表现出强大而狭窄的抗生素活性。因此，研究人员筛选了针对其他革兰氏阴性菌具有抗生素活性的murepavadin类似物。

Luther 和同事们用化学方法将通过该筛选鉴定出的化合物与另一种抗生素多粘菌素B的一部分联系起来，后者直接与LPS结合。完整的多粘菌素能有效地破坏细菌的细胞膜，杀死细胞，但对人体却有相当大的毒性。研究人员希望仅连接多粘菌素B的LPS结合部分可以增加其murepavadin类似物的膜靶向性。实际上，他们的策略在体外和感染了肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌(包括耐药菌株)的小鼠体内，都产生了一些具有强大活性的嵌合体。值得注意的是，嵌合体在小鼠中表现出低毒性。

人们可能认为嵌合体会以LptD为靶标，但是当Luther和同事测试其相互作用时，他们发现了BamA作为目标的证据。研究人员分析了对嵌合体有抗性的肺炎克雷伯菌菌株。他们发现耐药菌株携带几个基因的突变，包括BamA和负责LPS修饰的基因。将野生型bamA基因重新引入耐药菌株中导致对嵌合体的敏感性增加，表明BamA在抗生素的作用机制中起作用。

在体外实验中，研究人员对嵌合体进行了荧光标记，并监测了与大分子蛋白(如BamA)结合的荧光变化，从而证实了嵌合体与BamA的直接结合。这与BamA的直接靶向一致。然而，当细菌直接用嵌合体处理时，外膜和内膜都迅速渗透;这表明这些化合物可能直接作用于细胞膜。研究结果表明，嵌合体的作用方式与多粘菌素类似，与BamA结合增强了它们的膜靶向性。

在第三篇文章中，Hart等人发现了一种化合物MRL-494，它对野生型大肠杆菌和一种外膜完整性和外排机制缺陷的突变体具有类似的抗生素效力，这表明该抗生素可能不需要穿透细胞来发挥其活性。在体外，MRL-494对革兰氏阴性病原体表现出中等效力，包括肺炎链球菌和铜绿假单胞菌。MRL-494在动物模型中的有效性仍有待测试。

研究人员表示，用该化合物处理大肠杆菌会导致外膜中OMP含量降低，提示BamA可能是一个靶标。为了证实这种可能性，Hart等人在大肠杆菌中发现了一种bamA突变，该突变对MRL-494具有耐药性。他们发现，尽管MRL-494可以抑制表达野生型bamA的大肠杆菌细胞中OMP模型的正常折叠，但它对耐药细胞的影响较小。研究人员发现，MRL-494可稳定BamA使其免受细胞中热诱导的蛋白质聚集的影响，表明两者之间存在相互作用，但MRL-494在类似程度上也稳定了抗性的bamA突变体。此外，MRL-494对缺乏BamA的革兰氏阳性细菌表现出类似的效力。因此，在革兰氏阴性菌中，MRL-494可能直接抑制BamA，也可能靶向外膜间接影响BamA功能。

总之，这些研究描述了对难以治疗的革兰氏阴性菌有效的新抗生素，考虑到化合物的大小和化学性质，它们很可能在细胞表面起作用，而无需突破渗透屏障。Imai等人提供了令人信服的证据，证明BamA是Darobactin的靶点，包括一个假定的结合位点，并且可以通过减少与耐药突变体的结合来证实。但是，就像MRL-494一样，还需要进一步的实验来确定其活性是否是由于对BamA的直接影响而引起。

未来的研究将为每种化合物鉴定其特定的BamA结合位点，并探究抗生素结合削弱BamA活性的机制，这将为抗生素德里进一步开发提供新的平台。此类研究将可能有助于揭示BAM如何介导OMP的插入和折叠，目前这方面的研究还比较少。

Darobactin和MRL-494是初始先导化合物，药物化学作用可以产生更有效的类似物，旨在确定其在动物模型中毒性的临床前研究也将很重要。Luther和他的同事的嵌合体正处于发展的更高级阶段，正如研究人员所阐述的，它们在动物模型中具有强大的体内活性以及良好的毒性，药代动力学及药效学，这类新发现的抗生素前景可观。 

参考来源: 《Nature》doi：10.1038 / d41586-019-03730-x