In Vivo CAR-T疗法非临床安全性评价的策略与关注点

体内嵌合抗原受体T细胞（in vivo CAR-T）疗法通过病毒或非病毒载体将CAR基因直接递送至患者体内，实现对T细胞的原位工程化改造，省去传统体外制备的复杂流程，具有成本低、可及性高、应用广泛等潜在优势。然而，其“体内生成”的特性也带来了新的非临床安全性挑战，包括细胞因子释放综合征、免疫效应细胞相关神经毒性综合征、遗传毒性、免疫原性及长期免疫缺陷风险等。

本文基于现有研究进展与监管指南，系统阐述in vivo CAR-T疗法的非临床安全性评价策略与关注点，涵盖药代动力学、毒理学、免疫原性、遗传毒性、生殖毒性及动物模型选择等内容，并结合典型案例分析其评价路径，以期为该类产品的研发与审评提供参考。

评价原则与指导依据

In Vivo CAR-T兼具基因治疗药物与细胞治疗药物双重属性，涉及多种递送载体，类型多样，机制复杂，其非临床安全性评价应遵循“基于风险”和“个案处理”原则，综合考量产品的作用机制（导入的基因或回输的细胞可能会直接影响心血管、中枢神经或呼吸系统功能）、生物分布（关键器官蓄积情况）、给药途径与临床适应症、产品组分（辅料、载体、表达产物）等。

相关指导原则包括中国NMPA《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》、EMA先进治疗医药产品（ATMP）指南及ICH S9、M3等。

表1 In Vivo CAR-T非临床安全性评价可参考的相关指导原则

发布/更新年份		指导原则名称	核心内容与适用性
FDA	2024年1月	Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products	CAR-T的综合性指南，涵盖CMC、非临床和临床
FDA	2013年11月	Preclinical Assessment of Investigational Cellular and Gene Therapy Products	提供细胞和基因治疗产品非临床研究的通用框架，涉及物种选择、研究设计、安全性终点等
ICH	2009年	S9: Nonclinical Evaluation for Anticancer Pharmaceuticals M3(R2): Guidance on Nonclinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals	In Vivo CAR-T可根据产品类型和适应症，参考相关指导原则开展一般毒理学试验
NMPA	2017年	细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）	确立细胞治疗产品非临床研究的总体框架，提出动物种属选择、GLP合规性及致瘤性评价的灵活性原则
NMPA	2021年	基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）基因治疗产品长期随访临床研究技术指导原则（试行）	国内核心指导文件，强调“基于风险的个案评价策略”，涵盖药效、生物分布、毒理学及致瘤性评价
NMPA	2022年	嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗产品申报上市临床风险管理计划技术指导原则	强调了对基因治疗产品（尤其是使用整合性病毒载体的产品）进行长期随访，以评估延迟性的致癌风险等
中国医学科学院肿瘤医院	2025年	体内生成类细胞治疗产品非临床研究内容共识	由中国医学科学院肿瘤医院等机构发布，该共识首次系统地规定了体内生成类细胞治疗产品非临床研究的必检内容，包括靶向效率、整合致瘤风险、免疫毒性等，可作为NMPA指导原则的重要补充
EMA	2025年1月	Guideline on quality, non clinical requirements for investigational advanced therapy medicinal products (ATMP) in clinical trials	明确ATMP（含CAR-T）在临床试验中的非临床要求，强调并非所有产品都需要完整的安全药理学研究，应基于风险判断

非临床安全性评价内容

与关注点

在 In Vivo CAR-T 疗法的非临床安全性评价中，需围绕安全药理学、一般毒理学、免疫原性及免疫毒性、遗传毒性、致癌性以及生殖毒性六大核心内容，系统评估产品对关键器官功能的影响、靶向与脱靶免疫反应所致的毒性风险、递送载体的生物安全性与免疫原性、整合或非整合载体的遗传与致癌风险，以及生殖系统的潜在暴露与发育毒性。具体研究内容与主要关注点如下表所示。

表2 In Vivo CAT-T疗法非临床评价

主要考虑点

非临床研究内容	主要关注点
安全药理学	评估对心血管、呼吸和中枢神经系统的影响关注免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）
一般毒理学	靶向/脱靶免疫反应导致的毒性递送载体相关的生物安全性与免疫原性组织趋向毒性评估
免疫原性与免疫毒性	病毒载体与LNP载体的免疫原性评估，细胞因子释放综合征（CRS）风险监测长期免疫毒性研究
遗传毒性	整合病毒载体的插入突变风险评估，非整合载体的潜在遗传毒性分析
致癌性	载体整合特性与致癌风险评估，长期监测数据与AI预测结合的综合评估
生殖毒性	病毒载体的生殖系传递风险评估，LNP载体的组织嗜性相关生殖/发育毒性

种属选择

动物种属的选择需考虑以下因素：产品到达靶部位或靶细胞的可行性/易感性；动物靶细胞的生物分布或生物学功能与人的相似性；荷载基因及其表达产物或转导产物的生物学功能与人的相似性。若产品具有高度人特异性且缺乏相关动物种属，则应考虑采用人源化动物和/或替代产品开展非临床研究。

表3 常用动物模型及其局限性

模型类型	优势	局限性
人源化小鼠	可使用临床拟用样品	存在移植物抗宿主病、免疫系统不完整问题
非人灵长类动物	具备完整免疫系统，适合评估免疫原性	需采用替代产品，无法充分代表临床样品

鉴于动物试验开展的客观困难，多个在研产品已采用药理、生物分布与毒性研究一体化设计策略。

药代动力学研究（生物分布）

药代动力学研究（生物分布）的核心目标是明确载体及转基因细胞在体内的分布模式，包括靶向器官、组织或细胞类型以及潜在的脱靶分布，从而为靶向特异性、安全性和有效性评价提供依据。同时，需开展脱落检测，监测复制缺陷型病毒的环境传播风险；尽管目前多使用复制缺陷型病毒，研究者仍在生物分布等非临床研究中对病毒脱落进行检测。在药代/药效方面，用于指导毒理学剂量选择的研究包括：通过 qPCR、ddPCR、流式细胞术、免疫组织化学（IHC）等方法测定体内 CAR 表达的时程曲线（CAR mRNA/蛋白水平），并结合功能性指标（如体内肿瘤杀伤或生物标志物变化）；此外，采用 qPCR/ddPCR 检测载体 DNA 或 mRNA 在血液及主要器官（肝、脾、肺、心、肾、脑、骨髓、淋巴结、生殖腺等）多个时间点的存在与水平，以评估载体/配方的生物分布特征。

一般毒理学

In Vivo CAR-T 疗法可能诱发的毒性作用包括：靶向免疫反应放大所致的毒性、脱靶免疫反应引发的毒性、脱靶基因转导相关的毒性，以及递送载体本身的生物安全性、免疫原性/免疫毒性和组织趋向毒性。可参考 ICH S9、ICH M3 及《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》等指导原则开展一般毒理学试验。鉴于该类产品在体内存续时间长、药效作用持久，试验设计时需纳入 CAR⁺ T 细胞的药代动力学指标，以充分评价毒性反应的持续时间与可逆性。

试验设计时至少采用一种相关动物种属开展试验，必要时使用多种动物；剂量应涵盖非临床药效模型确定的药效剂量范围或拟推荐的临床剂量范围。除常规观察指标外，还应结合基因治疗产品特性，考察载体和导入基因在体内的转录/翻译、分布、存续情况。

免疫原性与免疫毒性

无论是病毒载体还是 LNP 载体均具有潜在免疫原性。病毒载体因 CAR 序列在基因组中永久整合，可能出现 CAR-T 细胞的活化、扩增及再扩增，引发免疫过度激活；LNP 平台虽具有瞬时表达特性，可能降低长期毒性风险，但在重复给药或高剂量下仍可能诱发急性炎症反应。通过早期识别细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性等信号，可为临床试验设计提供安全性依据。

在早期产品设计阶段，可采取措施降低免疫原性、提高稳定性，例如，INT2104 通过对 VSV-G 蛋白进行工程化改造（氨基酸替换减少脱靶结合）以增强血液稳定性；VivoVec 颗粒采用融合病毒糖蛋白（假型化）以抵抗人血清灭活作用；LNP 载体通过环化 RNA（circRNA）降低免疫原性并延长体内表达持续时间。

遗传毒性

已有文献报道，采用整合病毒载体的 ex vivo CAR-T 存在整合插入突变导致的致癌性风险。对于 In Vivo CAR-T，体内环境更为复杂，载体（如慢病毒）的整合可能影响非靶细胞（如造血干细胞）。因此，遗传毒性研究通常被作为评估 In Vivo CAR-T 安全性的核心环节。例如，UB-VV111 在非临床研究中开展了遗传毒性风险评估，结果显示其载体拷贝数较低（平均每个 CAR-T 细胞仅 1.77 个拷贝），且整合插入位点分布类似于已上市的慢病毒载体 ex vivo CAR-T。对于采用非整合病毒载体（如腺相关病毒、LNP）的 In Vivo CAR-T，由于其基因非整合特性，遗传毒性风险相对较低，但仍需关注可能诱发遗传毒性的因素（如环状 RNA、LNP 脂质成分等），必要时开展相应的遗传毒性试验。

致癌性

致癌性评价应根据产品特征及临床适应证综合考量。当标准致癌性试验不可行时，可采用体外、体内等多种证据对致癌性风险进行综合评估。证据来源可包括：载体整合特性与靶向/脱靶转导性；药物靶点及其药理作用通路与肿瘤发生发展的相关性；非临床与临床研究的长期监测数据；生产体系中可能存在的潜在致癌风险；以及人工智能（AI）预测结果等。

生殖与发育毒性

生殖与发育毒性评价旨在评估 In Vivo CAR-T 产品潜在的生殖和发育毒性风险，应基于产品特性、作用机制、临床适应证及拟用人群，结合一般毒理学试验中的发现与生物分布信息综合分析。对于病毒载体产品，需重点关注生殖系传递风险；若载体在性腺中持续存在，应进一步研究其在生殖细胞（如卵母细胞、精子）中的暴露水平，必要时开展生殖系传递试验。对于 LNP 载体产品，虽基因整合风险较低，但仍需评估其组织嗜性所引起的潜在生殖与发育毒性风险。

在 In Vivo CAR-T 疗法的非临床研究中，若多个产品采用相同的递送载体平台技术，监管机构对此类平台技术的沟通交流申请界定标准极为严格。评估需基于载体特性、生产工艺及质量属性，并结合同一平台下其他产品的开发进程，开展药学、药理毒理及临床等专业性综合评估。由于 CAR 基因荷载具有特殊性，即使采用同一递送平台，不同 CAR 基因所对应的“在靶”与“脱靶”风险可能存在显著差异，因此可能不适宜单纯基于平台技术进行监管。然而，同一平台技术产品在载体生物分布、安全性等方面，一定程度上可实现研究数据的共享。

In Vivo CAR‑T 疗法兼具基因治疗与细胞治疗产品的双重属性，其“体内生成”的特性对非临床安全性评价提出了复杂挑战。评价策略应遵循“基于风险”和“个案处理”的基本原则，重点考察产品的药理/药效作用及其毒性风险特征，尤其需关注药效与药物暴露/生物分布之间的关联。在整个研发与评价过程中，各阶段均应积极与监管机构保持沟通。

参考文献：

周宇,张旻,闫莉萍. 体内嵌合抗原受体T细胞(in vivo CAR-T)研究进展及非临床研究一般考虑[J]. 中国药物评价,2025,42(6):409-415. DOI:10.3969/j.issn.2095-3593.2025.06.001.
Joel G. Rurik et al. CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury.Science375,91-96(2022). DOI:10.1126/science.abm0594
Schubert ML et al. Side‑effect management of chimeric antigen receptor (CAR) T‑cell therapy. Ann Oncol. 2021,32: 34‑48. DOI: 10.1016/j.annonc.2020.10.478

作者简介

周莉

医学博士，研究员。湖北天勤生物科技集团股份有限公司执行副总裁，武汉分公司总经理，药物临床前研究与安全性评价湖北省工程研究中心负责人，武汉产业领军人才。

主持武汉市妇幼用药临床前研究中试平台，主持武汉市药物非临床研究与安全性评价中试平台。

主要学术兼职：中国毒理学会第八届生殖毒理学专业委员会主任委员、中国实验动物学会实验动物与毒理学专业委员会主任委员、中国毒理学会第九届生殖毒理学专业委员会秘书长、中国毒理学会常务理事、中国实验动物学会理事、中国毒理学会生物技术药物毒理与安全性评价专业委员会常务委员、中国环境诱变剂学会致突变专业委员会副主任委员、中国药理学会安全药理学专业委员会常务委员、中国药学会应用药理专业委员会委员、国家食品药品监督管理局（CFDA）审核查验中心GLP认证专家和药物审评中心专家、中国合格评定国家认可委（CNAS）GLP检查专家等20余项学术职务。

主持或负责600多个新药的非临床安全性评价项目和申报工作，120余项新药已通过NMPA评审获得临床批件/临床许可或新药证书，20项评价的新药获FDA临床许可，1项评价的新药获得TGA批准；主持或参与国家级和部委级课题研究10项；作为项目负责人，主持《上海市妇幼用药非临床评价专业技术服务平台》；作为副组长和子任务负责人，主持“重大新药创制”科技重大专项“十三五”计划《药物非临床生殖与发育毒理学关键技术的建立及应用》，以及十二五“重大创新药物创制”专项《建立符合国际新药研究规范的临床前安全评价技术平台》。

主编出版专著《食蟹猴生殖与发育毒理学》、《儿科用药非临床安全性研究》、《药物生殖与发育毒理学》、《常见实验兔和大鼠畸形图谱》、《药物生殖与发育毒理学发展史》和《前列腺毒理学》等7部，副主编出版专著《生殖药理学》和《前列腺药理学》2部，参编5部。

关于天勤生物

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