新药临床试验中生物标志物定量分析专家共识

《中国新药与临床杂志》2025年

生物标志物；临床试验；定量分析；方法学验证

对生物标志物分析方法进行验证时，其验证级别应遵循“适用性”（fit for purpose，FFP）原则，紧密契合生物标志物的具体应用场景。该原则具体体现为以下两类验证级别：完整验证和方法确证。完整验证主要用于支持药物临床试验的替代终点、关键性指标等监管决策，建议生物标志物的定量方法参照人用药品注册技术要求国际协调理事会（ICH）发布的《M10：生物分析方法验证及样品分析》（ICH-M10）指导原则，进行完整验证。方法确证主要用于支持药物研发的内部决策（如候选物筛选或概念验证）或临床研究的探索性目的，其结果虽可提交至监管机构，但不作为关键监管决策的直接依据。

需特别注意的是，生物标志物的应用场景可能随药物研发进程动态变化，其分析方法的验证策略也需相应调整。早期研究阶段（如内部决策和概念验证）通常采用方法确证即可；而进入关键临床试验阶段，若生物标志物用于安全性或有效性评价、或支持给药剂量决策，则必须进行完整验证，以确保关键试验样品数据的可靠性。

在验证过程中，应全面考察检测方法的各项特性。在验证项目的设置上，需结合所采用的检测技术类型予以考虑，主要验证项目见表1所示。在实际验证过程中，方法确证应依据生物标志物的具体应用场景，从上述项目中选择合适的参数组合开展；完整验证则需系统完成全部所列项目的评估，并参考ICH-M10等指南中规定的接受标准。另外，还应根据具体情况，考虑对诸如药物靶点干扰等其他潜在影响因素进行补充验证，以保证分析方法在真实实验环境下的可靠性。

此外，若生物标志物检测用于临床试验中的受试者管理，除需遵循生物分析相关指导原则外，还应符合临床检测的特殊要求。推荐由通过中国合格评定国家认可委员会（CNAS）等权威机构认证的中心实验室执行方法验证及样本检测，以增强方法的稳健性，并确保结果数据的可比性与可靠性。

在进行方法学验证前，应充分了解生物标志物的生物学功能、体内预期浓度变化范围、样品类型、潜在干扰物、采集方法、样品运输条件、检测平台、分析方法性能等信息，开展生物标志物定量分析方法的建立。在上述过程中应特别关注以下四个方面：

1 标准品、内标和关键试剂

当采用LC-MS法检测小分子或多肽生物标志物时，推荐使用化合物对照标准物质和稳定同位素标记的内标。当稳定同位素标记的内标难以获得时，也可使用相关物质作为内标，但应考虑对照标准物质在回收率或基质效应方面的潜在差异，以及对分析物检测的潜在干扰。

当采用配体结合法检测蛋白质或高分子量肽时，通常使用重组表达并经纯化的标准品，但应当注意，重组表达的标准品可能与体内真实的内源性分析物存在差异，其特性和浓度值存在未被明确定义的风险，并且随着时间的变化，批与批之间也会存在差异，应对过期或新批次标准品进行验证。

关键试剂是指在配体结合法中，对分析结果有直接影响的试剂。由于关键试剂批次的变化可能会影响分析结果，因此建议确定关键试剂的批次间变异性。

2 校准曲线和质控样品基质的选择

空白基质或低浓度真实基质在生物标志物的定量分析中较难获取，因此生物标志物的定量分析一般使用替代基质来制备校准曲线样品。替代基质主要包括磷酸盐缓冲液（PBS）、含有牛血清白蛋白的PBS、不同种属的基质（不含待测物或含少量同源干扰物）、通过活性炭、亲和柱、高温孵育、酸碱水解等方式去除内源性物质的基质等。替代基质与真实基质存在差异，应在方法开发阶段考察替代基质与真实基质的相似性，选择最相似的替代基质作为制备校准曲线的基质。

质控样品可采用三种方法制备：(1)真实基质质控样品；(2)真实基质外添加质控样品；(3)替代基质质控样品。具体见表2。

3 定量范围的确定

定量范围被定义为从LLOQ到ULOQ的范围。对于LC-MS法，一般可以结合目标人群中生物标志物的水平以及药物干预后生物标志物上调或下调的水平合理制定。对于LBA法，除了考虑生物标志物的变化范围外，还需综合考虑LBA方法本身响应与浓度拟合较好的范围，优先保证LLOQ能覆盖生物标志物在体内变化的最低浓度。对于ULOQ，样品可通过稀释至标准曲线范围再进行检测。同时需要尽早考察平行性，并确认超过ULOQ浓度的真实样品稀释回线性范围内的高中低浓度测得的浓度，是否与预期浓度一致。

4 最低需求稀释度（MRD）的确定（仅适用于LBA法）

MRD是一个稀释因子，通过稀释样品的方法，减少背景信号或基质对LBA分析的干扰。当校准曲线样品采用缓冲溶液进行配制时，通常无需进行MRD稀释；而当校准曲线样品采用真实基质或不同种属基质时，一般采用与真实样品相同的MRD操作步骤进行稀释。

建议优先选择高浓度真实样品进行梯度稀释，以确定最小推荐稀释度（MRD）并优化检测方法。可采用缓冲溶液梯度稀释法进行评估，当某一稀释倍数及其更高稀释倍数的回算浓度均趋近理论添加浓度，或不同稀释倍数间回算浓度差异较小（通常≤30%）时，该系列稀释中最小的稀释倍数即认定为最低需求稀释度。在检测真实样品前，如果高浓度真实样品无法获得，那么可采用外添加高浓度待测物的方法考察真实样品的稀释线性。当高浓度真实样品可以获得时，仍需及时开展高浓度真实样品的梯度稀释实验（平行性），以确保所确定的MRD适用于真实样品检测。

对于生物标志物定量分析方法学的验证参数，行业内已经形成一定的共识。生物标志物定量分析方法的重要的验证参数包括：校准曲线定量范围、灵敏度、准确度与精密度、选择性与特异性、平行性、可重复性和稳定性。

对于生物标志物分析方法的完整验证，尤其是色谱法和基于配体结合的分析方法，应参照ICH-M10中针对药物分析方法所确立的技术框架作为基础。需要指出的是，ICH-M10指南中提出的部分特征或标准可能不完全适用于特定生物标志物分析，或者需针对其他类型生物分析平台的技术特性进行差异化考量。因此，在方法学验证报告中需对上述差异进行科学合理的解释与论证。

在方法确证中，可基于研究目标对接受标准进行适度调整，但需在验证和样品检测开展前，依据FFP原则，明确需要开展的验证项目及其接受标准。生物标志物分析方法验证的核心在于充分理解其生物学特性及生物变异规律，从而设计出与研究目的高度适配的专属分析方法，并据此确立验证接受标准。需强调的是，接受标准的制定应以满足研究预设的科学需求为导向，而非单纯反映分析方法的技术性能极限。

1 校准曲线定量范围

生物标志物的校准曲线和定量范围可采用低内源物浓度的真实基质或者替代基质进行配制。对于完整验证，校准曲线的浓度、样品数量和接受标准，参照ICH-M10。对于方法确证，接受标准可适当放宽。

2 准确度和精密度

生物标志物分析方法的准确度和精密度分为绝对准确度和精密度，以及相对准确度和精密度。绝对准确度和精密度一般采用替代基质质控样品考察质控回算浓度与理论浓度的差异。公式：绝对准确度%=替代基质质控样品/理论浓度×100%。

相对准确度和精密度一般通过筛选真实基质高浓度、中浓度和低浓度样品，配制真实基质质控样品进行考察（必要时，也可增加ULOQ和LLOQ浓度），应尽量覆盖待测物在群体中的浓度范围。真实基质质控样品的浓度通过重复测定进行定值。再进行准确度和精密度的考察，计算相对准确度。公式：相对准确度%=真实基质质控样品浓度/定值浓度×100%。

3 选择性

在方法学验证中，通常通过向不同来源的空白基质添加低、高浓度分析物来评估方法选择性。然而，生物标志物通常在真实基质中已存在较高的本底浓度，难以获得真正的空白基质，因此无法采用外加标准品的方式评估方法的选择性。在这种情况下，可通过平行性验证的结果来评价方法的选择性。同时，建议对至少1个来源真实基质添加红细胞的溶血基质和脂血基质进行选择性的考察，以评估溶血和高脂血对检测结果的影响。

4 特异性

特异性是考察定量分析方法能否明确区分待测物与干扰物的能力。建议使用可以获得的相关物质（包括样品中可能存在的干扰物，如受试药物等）作为干扰物质，添加到含有待测物的真实样品中，以评价干扰物质对待测物检测结果的影响。例如，在进行靶点生物标志物的定量分析时，受试药物通常被视为干扰物质。当进行游离靶点和总靶点的生物标志物的验证时，应确保游离靶点和总靶点的生物分析方法不会受到受试药的干扰。

通过向较低浓度和较高浓度真实样品中添加干扰物的方法进行考察。干扰物添加浓度应模拟干扰物的生理浓度或更高浓度。通常真实样品在临床试验启动前较难获得，在开发阶段进行特异性难度较大，建议在临床样品分析阶段可进行特异性考察。

5 基质效应

生物标志物通常具有内源性基线浓度，难以获得真正的空白基质，因此，在LC-MS/MS法中无法采用向空白基质添加标准品的方法考察基质效应。一种可行方式是使用标准曲线的空白替代基质配制低、高浓度质控样品，将其响应值与相应浓度的化学品溶液响应值比较。样品响应值/化学品响应值=1时，表示无基质效应；小于1为离子抑制；大于1为离子增强。然而，替代基质与实际生物基质可能存在差异，所得结果仅具参考意义。一般情况下，LBA法无需考察基质效应。

6 平行性

对于LBA法，平行性的考察是重要的。平行性定义为校准曲线和系列稀释真实样品之间的平行关系，以检测稀释对待测物定量的影响。平行性应采用高浓度真实样品进行评价。使用校准曲线配制时使用的基质对样品进行梯度稀释，证明梯度稀释后，真实样品回算浓度的平行性。

7 稀释线性（稀释可靠性）和钩状效应

对于LBA法，如果在分析方法验证阶段无法获得高浓度真实样品，考察稀释线性是有意义的；反之，如果已在方法验证中考察通过平行性，且稀释倍数已包含所有样品检测的最大稀释倍数时，可以不进行稀释线性的考察。对于钩状效应，建议通过高于定量上限样品的信号值来验证是否存在响应抑制现象。

8 残留

对于LC-MS法，应参照ICH-M10对残留进行考察。对于LBA法，一般不会出现残留效应的问题。如果分析平台出现残留的趋势，也应参照ICH-M10开展验证。

9 稳定性

生物标志物的定量分析中，校准曲线通常采用替代基质进行配制和分析。为确保校准曲线样品和真实样品的稳定性，建议同时考察替代基质和真实基质中生物标志物的稳定性。

10 进样重现性

对于LC-MS法，可参照ICH-M10开展验证。对于LBA法，无需考察此项目。

11 稳健性

对于LBA法，由于样品孵育时间等条件的差异，可能会对结果产生影响，因此建议开展方法稳健性的验证。考察最短孵育时间和最长孵育时间的差异。上述实验可单独开展，也可以整合在准确度和精密度验证中。

1 样品检测

在支持监管决定的临床研究中，样品检测的接受标准需参考《ICH-M10开展。在用于内部决策的临床研究中，接受标准可适当放宽，但应在样品检测开展前根据FFP原则，合理确定接受标准。

2 已测样品再分析（incurred sample reanalysis, ISR）

在支持监管决策的临床研究中，若生物标志物作为临床研究的替代终点时，建议进行已测样品再分析（incurred sample reanalysis, ISR）来确认分析方法的重现性。建议在初测浓度≥LLOQ的研究样品总数≤1000的情况下，重新分析约10%的样品，在初测浓度≥LLOQ的研究样品总数>1000的情况下，重新分析前1000个样品的10%(即100个)加上超过1000个样品的大约5%。应通过评价分析变异性来确认研究样品分析中分析方法的有效性。在用于内部决策的临床研究中，可根据FFP原则合理确定是否开展ISR。

3 样品重分析

在开始样品重分析前，应明确研究样品重分析的原因、重复次数和选择报告值的决策标准。开展样品重分析的原因包括但不限于以下几种：(1)校准曲线和QC样品不符合预定义的接受标准；(2)样品浓度高于ULOQ；(3)在校准曲线中剔除最低校准标准点LLOQ的批次中，样品的浓度低于LLOQ；(4)进样不当或设备故障等。可参考ICH-M10制定样品重分析的标准操作规程。建议制定非分析原因（如生物标志物变化趋势不符合预期等）的样品重分析以及以调查为目的的样品重分析的标准操作规程，对于支持监管决策的生物标志物，应慎重开展非分析原因的样品重分析。

1 实验室管理体系

生物标志物定量分析的实验应参照相关指导原则要求，建立完善的实验室管理制度，包括但不限于人员的资质、培训记录；仪器校准维护和保养；样品接收、储存、存取、销毁的流程；项目相关文件记录与报告等。对于多中心临床研究，推荐由经过认证的中心实验室开展临床试验的生物标志物定量分析，以确保分析方法的稳健性、数据的可比性和可靠性，避免分析方法转移对结果一致性和可比性的风险。

2 商品化试剂盒的方法验证和样品检测

商业化试剂盒常用于临床试验生物标志物的定量分析。应根据生物标志物的应用场景，确定验证级别、验证参数和接受标准。此外，应选择有效期较长的商品化试剂盒，并尽可能减少批次变更的情况。当试剂盒临近效期时，应谨慎选择延期或更换新的批次或厂家。若进行试剂盒延期，应在每个后续批次中评估随行质控的检测结果，并预先确定接受标准。在更换新的批次时，建议进行桥接试验验证。若更换厂家，则建议进行验证。

3 样品前处理过程对分析结果的影响

在生物标志物的定量分析方法中，一些样品前处理步骤（如全血刺激，单个核巨噬细胞提取、血小板提取等）的时效性和批间一致性对检测结果的影响，可能大于定量分析方法的变异度对检测结果的影响。因此在方法学验证和样品检测中，应整体考虑这些样品前处理过程对分析结果的影响，建议在方法学验证中增加对样品前处理变异度和方法稳健性的考察，保证样品前处理过程的时效性、合理性和科学性。

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