Tivantinib临床失败启示：早期药物发现中细胞靶标结合检测的重要性

Tivantinib临床失败启示：早期药物发现中细胞靶标结合检测的重要性

在药物研发的漫长赛道上，确认化合物在活细胞内与靶标的结合是"苗头化合物到先导化合物"转化的关键判断点之一。前期投入数亿资金、耗时数年，最终临床试验失败的Tivantinib（ARQ197）案例，就是这样一个值得所有药物研发企业警醒的教训。

Tivantinib为何被误判为MET抑制剂？

MET激酶是抗癌药物研发中的重要靶点，其在多种肿瘤中异常活化并可驱动肿瘤进展。作为抗癌领域的潜力候选药，Tivantinib在早期研究中展现出"令人鼓舞" 的结果：

1. 抑制 MET 及其下游信号通路的磷酸化；

2. 对表达 MET 的癌细胞系的细胞毒性；

3. 在异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性（1）；

4. 甚至解析出的 MET-Tivantinib 复合物共晶结构（2）。

这些数据使Tivantinib被视为高潜力候选药物，并进入针对MET高表达肿瘤的III期临床。然而，III期研究未能证实其疗效，项目最终终止（3、4）。

后续发表的两篇文章的作者均对诱导肿瘤细胞毒性的作用机制提出了质疑（5、6）：Tivantinib 对 MET 依赖型和非依赖型细胞具有相似的杀伤效力，观察到的细胞毒性更可能是由于微管动力学受到干扰，而非 MET 抑制所致。如果在最初的临床前研究直接评估 Tivantinib 与 MET 的细胞结合情况，而不是通过分析 MET 磷酸化来间接推断，是否会得出不同的临床前建议？

细胞靶标结合及其在探针开发和药物发现中的作用

在开发新的小分子探针或治疗药物时，理解化合物如何与其靶标相互作用是至关重要的一步。药物研发中，化合物与靶标的相互作用验证，传统上有两类方法：

一、生化检测：具有靶标特异性、定量性且操作往往较为简单。但缺乏细胞环境的复杂性，在细胞环境中，诸如膜渗透性、内源性配体的竞争以及蛋白质复合体的形成等因素都可能影响化合物的结合。

二、细胞功能检测：能够反映化合物的下游效应，包括基因表达或细胞活力等。但细胞功能检测的结果解读可能更为复杂，因为脱靶相互作用、间接机制和/或补偿通路都可能影响检测结果。

当生化检测与细胞功能检测结果不一致时，这种差异给化学探针和药物开发带来了重大挑战。一种化合物可能在生化检测中表现出强活性，但由于诸如渗透性差、存在细胞代谢物或生化体系中未体现的蛋白质相互作用等因素，而无法在细胞内结合靶标。同样，一种改变细胞功能的化合物，其作用机制可能涉及非靶标蛋白的意外通路，而非直接抑制目标靶标。

细胞靶标结合检测能够直接测量化合物在活细胞中与靶标的结合，从而填补生化检测与细胞功能检测之间的差距，为这种相互作用提供直接证据。

细胞靶标结合检测技术

细胞靶标结合检测是基于细胞的检测，具有靶标特异性，使研究人员能够在更具生物学相关性的背景下确认化合物与目标靶标的结合。可用于优化化合物，以提高其细胞活性、亲和力和渗透性，并帮助验证作用机制。事实上，细胞靶标结合已被确认为药物发现中基于细胞的临床前靶标验证过程的关键支柱之一（7）。

化学探针常与 siRNA、CRISPR 和基因敲除等互补遗传技术一起使用，以验证靶标在健康和疾病模型中的作用。尽管这两种方法通常得出一致的结果，但偶尔也会出现差异（8）。如果没有直接确认化学探针与靶标的结合，这些差异可能被解释为化学探针缺乏特异性。然而，直接证明化学探针与靶标的结合，可以揭示药理学与遗传学结果之间的差异可能源于潜在的生物学区别。例如，遗传方法通常会同时去除靶标的酶功能和结构/支架功能，而化学探针通常仅抑制酶功能，保留结构功能不变。认识到这些生物学细微差别，有助于探索替代治疗策略或利用/保留这些独特靶标功能的新模式。

近年来，多种技术在活细胞靶标结合检测方面取得重要进展，按其原理可分为以下几类（9）：

一、无探针技术

适用于缺乏已知配体的靶点的命中化合物发现。

1. 细胞热迁移实验（CETSA）

将细胞加热至不同温度，被药物结合稳定的蛋白质保持折叠状态，而未结合的蛋白质则发生变性并聚集。未聚集的蛋白部分可以通过识别目标蛋白的免疫检测方法或质谱法进行检测。

2. 基于报告基因的 CETSA 检测

是 CETSA 技术的衍生方法。通过将报告基因标签与目标蛋白融合，可以更轻松地通过相应的报告基因检测来观察目标蛋白的聚集情况，从而简化检测开发流程并实现更高通量。

二、依赖探针技术

直接测量测试化合物的结合和靶标占有率，并且可以在生理温度下进行。

1. 化学蛋白质组学

通过质谱技术与亲和探针或活性探针的结合，已成为探索蛋白质组范围内结合相互作用的强有力工具。该方法中使用的探针可以源自目标化合物本身，也可以来自广泛结合一组相关靶标的多向性工具化合物。这些探针中还包含捕获基团，使得在质谱检测之前，可以将探针结合的靶标蛋白质从细胞环境中分离出来。未修饰测试化合物与靶点的结合能力，通过其对探针的置换程度来量化——置换导致靶标在定量质谱分析中的富集水平降低。

2. NanoBRET® Target Engagement (TE)

另一种基于探针置换的方法，利用生物发光共振能量转移（BRET）来表征活细胞中的化合物-靶标相互作用。NanoBRET® TE 平台依赖于 NanoLuc® 萤光素酶标记的目标蛋白（供体）与结合该靶标的荧光标记小分子示踪剂（受体）之间的能量转移。当两者距离足够近时，会发生能量转移，产生BRET信号。化合物结合导致示踪剂被置换，从而引起 BRET 信号减弱，由此测量细胞中的靶标结合情况。由于 BRET 信号可以实时从活细胞中检测，NanoBRET® TE 技术允许对化合物结合进行亲和力测量以及动力学滞留时间分析。

Tivantinib 似乎并未在细胞中直接结合MET

回到Tivantinib案例及本文开头提出的关于其细胞靶点的问题，我们已将细胞靶标结合检测作为一种替代性更强、更直接的评估方法，用于判断 Tivantinib 是否与 MET 激酶结合。如果采用细胞靶标结合检测来分析 Tivantinib，它是否能有效结合 MET？我们尝试通过使用 NanoBRET® TE 平台来测量 Tivantinib 与 MET 的结合情况，以回答这一问题。

上图.我们利用 NanoBRET® TE 检测定量分析了 Tivantinib 以及两种已获 FDA 批准的 MET 抑制剂（Cabozantinib 和 Capmatinib）在活细胞中对 MET 的表观亲和力。

该检测未显示 Tivantinib 在活细胞中与 MET 激酶存在有意义结合，这与最初关于 Tivantinib 的报告中磷酸化检测的结果相反。然而，使用相同的细胞 NanoBRET® TE 检测方法，对两种已获 FDA 批准的靶向 MET 的激酶抑制剂药物 Cabozantinib 和 Capmatinib 进行检测时，两种抑制剂均显示出纳摩尔级别的亲和力。这一 NanoBRET® TE 检测结果与一项化学蛋白质组学研究结果一致，该研究发现基于 Tivantinib 的亲和探针在从细胞中富集 MET 方面显示出较低的富集程度，表明 Tivantinib 对 MET 的结合较弱（10）。

结合将微管确定为 Tivantinib 可能靶标的研究，细胞靶标结合检测提供了令人信服的证据，表明 Tivantinib 并未在细胞中直接抑制 MET。

回顾 Tivantinib 的最初研究报告，可以找到关于该候选药物为何可能被误认为是细胞内 MET 抑制剂的一些线索。有观点认为，在分析靶标磷酸化之前进行了 24 小时的药物处理，这为非靶标效应和/或补偿通路干扰结果提供了机会，从而导致了 Tivantinib 被错误地归类为 MET 抑制剂。然而，对于细胞功能检测而言，事先很难知道测定药物作用的最佳条件，以便能够轻松区分靶标结合的直接效应与其他细胞过程。

需要特别指出的是，那些反映化合物-靶标结合下游靶标活性的细胞功能检测（例如细胞毒性检测）更容易受到多种因素的干扰，包括非特异性相互作用、非靶标效应以及来自其他细胞过程的信号串扰。要建立药物处理与生物反应之间的联系，需要进行严谨的实验设计与数据解读。而细胞靶标结合检测则提供了一种强有力的工具，用于确立与期望生物效应相关的靶标结合。

结论

细胞靶标结合检测代表了药物发现和化学探针开发领域的一项关键进展，填补了生化特性表征与功能性细胞响应之间的鸿沟。Tivantinib 的案例研究凸显了这一鸿沟——即便采用了严格的生化及细胞功能检测，仍可能导致对化合物作用机制的误判。以微管而非MET为靶点并不会立即否定Tivantinib类药物的治疗潜力，因为靶向微管的药物已在临床上取得成功（11）。然而，对 Tivantinib 细胞靶标的错误认定对临床试验设计产生了重大影响，这可能是其临床阶段失败的部分原因（5）。此外，尽管已有研究表明 Tivantinib 在细胞中并未结合 MET，但这一错误认定依然存在，近期一些出版物仍在使用 Tivantinib 来探究 MET 在癌症中的作用（12、13）。

Tivantinib 的案例凸显了在药物发现早期引入细胞靶标结合检测的重要性，以便在细胞中确定真实的化合物-靶标相互作用，并据此进行优化。通过在活细胞的生理相关环境中直接评估结合相互作用，研究人员可以将研究重点放在那些作用机制已获验证的化合物上，从而避免代价高昂的误判和后期失败。随着新技术的不断发展，细胞靶标结合检测的能力将进一步扩展，这将有助于开发更可靠的化学探针和有效的治疗药物，并引导科学界对生物数据进行更清晰、更准确的解读。

在药物研发竞争日趋激烈的当下，精准、高效的技术工具成为核心竞争力。Promega 的 NanoBRET® TE 技术经过开发，可用于检测>350种全长激酶。以其直接、精准、高效的特点，帮助药企在临床前阶段看清化合物与靶标的真实相互作用，让药物研发少走弯路，助力更多有效药物顺利走向临床。

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药物:靶蛋白相互作用细胞学检测技术

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参考文献：

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