随着mRNA新冠疫苗成功，RNA药物进入快速发展阶段。就在上一周，国产首款mRNA新冠疫苗迎来上市，石药集团创造中国奇迹。在全球范围内，RNA疗法为各国研究人员扩大药物开发靶点范围提供了独特机会，其作用靶点的多样性引起了领先的科研机构、新兴生物技术公司和大制药公司极大关注。目前有多种不同类型RNA疗法在研发过程中，主要包括反义寡核苷酸（ASO）、小干扰核酸（siRNA）、微小RNA（miRNA）、信使RNA（mRNA）、Aptamer（核酸适配体）等等。作为一类新型药物治疗形态，可对常规药物分子无法靶向的蛋白质和基因进行选择性作用，RNA核酸药物已经在多种疾病中应用。
尽管RNA疗法研发取得了非凡进步，还有很多问题和挑战亟需克服，如RNA高度不稳定、体内递送效率低、宿主细胞免疫原性等等。RNA分子以药物或靶向RNA小分子形式直接用于治疗两种模式。RNA药物可利用内源性调节机制，并可特异性调节目标靶点。RNA药物须通过细胞膜并具有结合细胞内靶标能力，并调控基因表达，进而实现相关蛋白质表达调节。
RNA疗法基本原理
蛋白质表达水平检测是药理药效研究非常重要的方面，目前有多种技术可以实现不同基质中分泌型和内源性蛋白质定量分析，例如ELISA技术，LC-MS技术、Western Blot技术等，也有一些创新性技术逐步被主流核酸药物公司所采用，本文将介绍核酸药物领导者采用全自动毛细管Digital Western技术（也称Simple Western技术）解决研发中蛋白质分析问题。
案例一：Moderna—临床前动物模型中蛋白质表达定量技术
Moderna公司目前在研临床I期mRNA疗法，mRNA-3927用于治疗丙酸血症（Propionic acidemia，PA）。
截图来源：药融云全球药物研发数据库
临床前小鼠动物模型研究表明，双RNA疗法可恢复代谢功能。丙酸血症是一种线粒体酶丙酰辅酶A羧化酶(PCC)缺乏引起固有代谢紊乱，PCC由六个α(PCCA)和六个β(PCCB)亚基组成。采用编码人类PCCA和PCCB的双mRNA组合，装载在可生物降解脂质纳米颗粒（LNP）中，在肝脏中可产生功能性PCC酶。
双mRNA编码的蛋白质比单独mRNA具有更高PCC酶活性。下图a-c是比较双RNA共转染与hPCCA或hPCCB mRNA单独转染数据。a和d图是酶活性评估，b和c图是采用毛细管Digital Western定量检测患者成纤维细胞中PCCA和PCCB蛋白质表达。
案例二：Arcturus Therapeutics—组织中定量检测hOTC表达
Arcturus Therapeutics公司临床阶段mRNA疗法ARCT-810用于治疗鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症 (Ornithine Transcarbamylase Deficiency, OTCD)。该疾病是尿素循环障碍中最常见的一种遗传性代谢病，OTC基因突变会导致高氨血症发作。
截图来源：药融云全球药物研发数据库
脂质纳米颗粒（LNP）装载的OTC mRNA（LUNAR-OTC mRNA）利用专有的脂质药物介导技术，可安全高效地将OTC mRNA递送到肝细胞内，使患者自身肝细胞内能自然产生功能正常的OCT酶。进而，临床前小鼠模型研究中，通过测量OTC-mRNA药物处理后小鼠肝脏和血浆中OTC酶活性和蛋白质表达，来反映LUNAR-OTC mRNA药物在小鼠模型中药效。
人鸟氨酸转氨甲酰酶 (hOTC) 在小鼠肝脏中蛋白表达。使用全自动毛细管Digital Western（Jess, Simple Western）系统定量检测小鼠肝脏中hOTC 蛋白表达，以重组蛋白为校正曲线来进行定量。使用抗人OTC抗体，从四个递增剂量组观察到明显的剂量反应，在未治疗OTC缺陷组或未治疗野生型组中未检测到hOTC蛋白。OTC蛋白表达水平与肝脏样本中OTC活性有很好的相关性。
案例三 ：Ionis Pharmaceuticals--ASO抑制RBM20可改善心力衰竭功能
射血分数（测量每次心脏收缩时离开心脏的血液百分比）保留的心力衰竭（HFpEF）是普遍和致命的。目前为止，没有很好的靶向治疗药物。病因之一是心室充盈受损，德国马克斯-德尔布吕克分子医学中心和Ionis Pharmaceuticals科学家使用靶向心脏剪接因子RBM20的反义寡核苷酸（ASO）可改善其功能。
在比刚度增加的成年小鼠中，2个月内每周给ASO可增加顺应性肌动蛋白异构体表达，并改善心脏功能。人类工程心脏组织中验证结果显示，在ASO治疗3周内RBM20表达下调至不到50%，导致没有心脏病理状况下适应性松弛动力学。本研究表明，抗RBM20 ASO可作为强大的心脏剪接调节剂，治疗人类HFpEF。
注射RBM20 ASO有效抑制小鼠心脏RBM20表达。(B)图是小鼠体内实验设计，(C)用PBS或ASO处理的野生型(WT)和N2B敲除 (KO) 小鼠心脏组织中的Rbm20 mRNA表达，（D和E）采用全自动毛细管Digital Western检测相应的RBM20蛋白表达丰度。mRNA和蛋白表达分子水平上，RBM20表达丰度下调50%以上。
Digital Western技术，加快核酸药物开发
以上Moderna、Arcturus Therapeutics和Ionis Pharmaceuticals三个案例是Digital Western代表案例，此技术已经广泛被RNA药物领域领导者采用。如mRNA药物领域的Moderna、BioNtech和CureVac等，ASO方面Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等，siRNA领域Alnylam、Dicerna和Arrowhead等，saRNA领域MiNA Therapeutics和中美瑞康等采用，及其他RNA疗法公司。
全自动数字化蛋白质表达定量分析系统 (Digital Western) 是美国Bio-Techne集团旗下蛋白质分析品牌ProteinSimple所有。全自动毛细管Digital Western技术作为创新性毛细管电泳免疫学技术，将Western Blot技术和ELISA技术合二为一，可利用微量组织样本实现内源性蛋白质精准的相对定量和绝对定量。作为创新型生物分析方法，其具备传统Western Blot蛋白质分子量可视化优势，定性更准确，同时具备ELISA和质谱技术精准定量性能，其灵敏度和精密度符合高标准生物分析要求。Digital WB自动化程度高，重复性好，灵敏度高和具有较宽动态检测范围，这些特点满足核酸药物研发不同阶段的目的蛋白定量需求，加快核酸药物研发。
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参考文献：
1、 Kanisht Batra, Sushila Maan and Anju Sehrawat. An Insight on RNA Based Therapeutics and Vaccines: Challenges and Opportunities.Current Topics in Medicinal Chemistry, 2021, 21, 2851-2855
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4、 Michael H. Radke, Victor Badillo-Lisakowski, et al. Therapeutic inhibition of RBM20 improves diastolic function in a murine heart failure model and human engineered heart tissue.Sci. Transl. Med. 13, eabe8952 (2021)
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