从FDA/EMA指南到实操落地：药物转运体DDI评价全流程，P-gp/OATP1B1等关键靶点研究方法详解

近年来，随着新药研发中药代动力学（PK）和药物相互作用（DDI）评价要求的不断提高，药物转运体研究已成为临床前与临床药理评价的重要组成部分。

美国FDA、欧洲EMA等监管机构均在相关指南中强调，应在适用情况下评估候选药物与关键药物转运体之间的相互作用，尤其是 P-gp、BCRP、OATP1B1/1B3、OAT1/3、OCT2、MATE1/MATE2-K 等与临床 DDI 密切相关的转运体。

与此同时，转运体抑制导致的他汀类药物暴露升高及肌毒性风险等临床案例，也推动了该领域研究方法的系统化和标准化发展。

一、转运体的分类及其生理意义

药物进入机体后，其跨膜转运并非完全依赖被动扩散。对于许多极性较强、分子量较大或带电的药物而言，脂质双分子层构成了重要屏障，其吸收、分布和排泄往往需要膜转运蛋白参与。

药物转运体广泛表达于小肠上皮、肝细胞、肾近端小管、血脑屏障等关键组织，通过摄取、外排、协助扩散或继发性主动转运等方式参与药物 ADME 过程。当前药物转运体研究中最常关注的两大类为：

• SLC 家族（溶质载体转运体）：包括 OATPs、OATs、OCTs、OCTNs、PEPTs、MATEs 等。该家族成员多通过协助扩散或离子梯度耦联的继发性主动转运发挥作用，常参与药物摄取，但并不都等同于“摄取转运体”；例如 MATE1/MATE2-K 主要参与肾脏和肝脏中有机阳离子的外排。SLC 家族成员既可介导药物进入细胞，也可在特定组织和膜面参与排泄过程。
• ABC 家族（ATP 结合盒转运体）：包括 P-gp/MDR1、BCRP、MRPs、BSEP 等，通常利用 ATP 水解提供能量，将底物从细胞内或膜内侧主动外排至细胞外、胆汁、尿液或肠腔等方向，是限制药物吸收、促进排泄和维持组织屏障功能的重要转运系统。

理解这套系统的运作机制，不仅关乎药物的代谢动力学，更直接影响药物相互作用的预测与临床安全性评估。接下来，我们就分层拆解当前主流的研究方法。

二、体外模型

体外模型因其操作可控、通量高、成本相对较低，是转运体研究的基础平台。主要包括基于膜的技术和各类细胞模型。

（一）基于膜的ABC转运体研究方法

这类方法的核心思路是：不用整个细胞，只取细胞膜制备成囊泡来研究转运体功能。

ATP酶活性测定法利用 ABC 转运体在转运循环中水解 ATP、释放无机磷（Pi）的特点，通过检测 Pi 释放量间接反映转运体活性。该方法操作相对简便，适用于早期筛选，但其结果属于间接信号，不能单独作为判断化合物是否为底物或抑制剂的依据。部分化合物还可能出现浓度依赖性的复杂反应，例如低浓度刺激 ATP 酶活性、高浓度反而抑制，形成“钟罩形”曲线。因此，该方法通常需要与膜囊泡转运实验、转染细胞实验或抑制实验联合使用，以提高判断可靠性。

外翻膜囊泡转运技术则更直观：将细胞膜外翻后制成囊泡，底物需要从囊泡外（相当于原来的细胞内）转运至囊泡腔（相当于胞外），模拟真实的外排过程。这一方法可以进行高通量筛选，且囊泡可以低温保存商业化供应，操作比转染细胞模型简便得多。不过，非特异性结合或底物从囊泡泄漏可能带来假阳性或假阴性，需要严格控制实验条件来降低干扰。

囊泡转运测定原理示意图（左）以及ATPase 测定示意图（右）

（二）细胞模型

体外细胞模型是研究药物转运体特性的核心手段。按照细胞来源分为原代细胞、永生化细胞系和转染细胞株三大类型。

转运功能测定是细胞模型中最常用的实验范式。将靶细胞接种于Transwell小室的渗透性滤膜上，形成极化单层细胞后，分别向腔侧室（A）或基底侧室（B）加入药物，定时从对侧取样并测定浓度，计算A→B和B→A两个方向的表观渗透系数（Papp）以及外排比（ER）。当ER大于2时，通常提示该药物存在主动外排转运。在特异性转运体抑制剂存在条件下重复上述实验，可进一步鉴定介导外排的转运体类型。

细胞摄取试验适用于摄取转运体（主要为SLC家族成员）的研究。将细胞接种于24孔、48孔或96孔培养板，形成单细胞层后，加入含药的摄取缓冲液孵育一定时间，吸去含药缓冲液，洗涤终止摄取，用适当方法定量细胞内药物含量。可使用荧光或放射性标记的转运体特异性探针实现高通量筛选。

外排试验可采用细胞悬浮液或单分子层两种方式进行。先将细胞与底物或待测药物预温孵，除去含药摄取液并洗涤后，加入不含药的摄取液温孵不同时间，测定细胞内残留药物量，以评价转运体的外排动力学特征。

常见的细胞模型各有侧重：

Caco-2 细胞模型源自人结肠腺癌细胞系，在特定培养条件下可分化为具有小肠上皮样特征的极化单层细胞，表达多种酶和转运体，是研究肠道吸收和外排转运的经典模型。其主要局限在于分化周期较长，通常约需 21 天；不同实验室间细胞来源、培养条件、紧密连接形成程度及转运体表达水平可能存在差异；同时，由于其内源性表达多种转运体，并不适合直接用于单一转运体功能的特异性判断。针对这一问题，研究者可采用基因编辑、RNA 干扰或稳定转染等策略建立特定转运体敲除、敲低或过表达的 Caco-2 亚系，以增强模型的机制解释能力。

原代肝细胞模型通过向大鼠或人体肝脏注入胶原酶消化分离获得新鲜肝细胞，悬浮于专用培养基或缓冲液后用于研究药物的摄取、代谢和肝清除。原代肝细胞的活力随时间下降较快，需在制备后立即或短时间内使用。三明治培养（SCH）体系将原代肝细胞置于两层胶原蛋白之间，大鼠SCH培养4天、人SCH培养6至7天后，肝细胞可形成紧密连接、完整管状网络及极化的外排功能，在较长时间内保持接近生理状态。SCH模型不仅表达功能活跃的基底外侧和顶端转运体，还表达多种代谢酶，是评估肝摄取与胆汁外排相互作用的重要工具，并可用于通过药代动力学模型估算体内肝胆汁转运动力学参数，进而结合PBPK模型预测体内DDI。新兴的3D PHH球体（3D PHH球体模型）可在至少5周的培养周期内保持表型稳定，高度表达I相和II相代谢酶（如CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4）及关键转运体（BSEP、NTCP、OATP1B1、OATP1B3等），被认为是很有前景的下一代体外研究模型。

人类三明治培养肝细胞中转运蛋白的极化表达

MDCK II 细胞模型来源于犬肾上皮细胞，易形成极化单层，常用于构建表达单一或多个外源性转运体的转染模型，如 MDCK II-MDR1、MDCK II-BCRP、MDCK II-MRP2 以及表达 OATP 等摄取转运体的模型。该模型背景相对简单、通量较高，但并非完全没有内源性转运体表达。转染过程也可能改变宿主细胞内在转运体或相关基因的表达。因此，在使用 MDCK II 转染细胞进行转运研究时，应设置野生型或空载体对照，以评估内源性转运和转染过程对结果的影响。

HEK293 细胞来源于经剪切的人腺病毒 5 型 DNA 转化的人胚胎肾细胞，因培养稳定、转染效率高、内源性药物代谢酶和部分转运体表达相对较低，常被用作表达 OAT1、OAT3、OCT1、OCT2、OATP、MATE 等外源性转运体的宿主细胞。需要注意的是，HEK293 并非“零背景”模型，实验中仍应设置亲本细胞或空载体细胞作为对照，以区分外源性转运体介导的特异性转运与宿主细胞本底摄取之间的差异。

HeLa细胞模型是最古老的永生化细胞系，有研究利用CRISPR-Cas9技术建立了稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系，用于构建基因敲除细胞文库，为筛选特定功能的未知蛋白提供平台。

CHO细胞模型中国仓鼠卵巢细胞被用于转染摄取和外排转运体。基于CRISPR-Cas9技术的位点特异性整合方法已被用于CHO细胞，解决了位点效应引起的长期表达不稳定问题。

LLC-PK1细胞模型来源于猪肾近端小管上皮细胞，广泛用于转染摄取和外排转运体研究。研究表明降低细胞外或增加细胞内pH可显著降低奎尼丁的摄取，提示存在H⁺/亲脂性阳离子反向转运系统。

脑微血管内皮细胞模型是构成血脑屏障的主要单元，原代或培养的脑微血管内皮细胞可保留体内血脑屏障细胞特点，被广泛用于研究药物在血脑屏障的转运及其转运体功能。永生化人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）保留了血脑屏障上多种转运体（MDR1、BCRP、MRP4等）和相应标志物，已被广泛用于研究药物在血脑屏障上的转运机制。

酵母模型具有单细胞真核生物的生物学和遗传学背景清晰、培养快速简便等特点，表达外源基因的酵母系统同时具备真核生物蛋白加工、折叠和翻译后修饰的功能，是研究新型转运体和评估转运体基因多态性的理想模型之一。

三、原位/离体模型

原位/离体模型（如离体灌流肠、肺、肝、脑和肾）常被用来研究药物在组织中的转运。与体外模型相比，原位/离体模型更接近生理状态，同时避免了其他器官对药物处置的影响。灌流法是在保证动物神经、内分泌、淋巴系统和生物转运功能等正常状态下，通过直接向组织器官灌注含受测药物的生理缓冲液，测定流出液或相应组织中药物或代谢产物的浓度，考察药物在相应组织中的转运情况。

（一）肠灌流法

在体肠灌流法是常用的研究小肠药物吸收转运的方法。动物禁食后，结扎胆管并分离肠段，两端插管并结扎，输入端连接恒流泵。随后灌入含药溶液，不同时间点从输出端收集灌流液或采集门静脉血，测定相应介质中药物和代谢产物浓度。在体肠灌流可保持血液供应、肠道药物代谢酶活性及神经内分泌的完整性。

在体单向肠灌流技术（SPIP）是生物药剂学分类系统研究化合物渗透性常用的技术手段。有研究者用SPIP结合PBPK模型，成功预测了多种中药单体成分在人体内的口服吸收行为。

离体外翻肠囊模型将大鼠麻醉后取出受试肠段，用Krebs-Ringer缓冲液冲洗后外翻，使肠黏膜暴露于外侧，结扎末端形成外翻肠囊。将肠囊放入含药的缓冲液中温孵一定时间，测定囊内外药物浓度变化，以评价药物跨肠壁转运情况。这一方法的局限在于缺乏体内蠕动状态和血液供应，随时间延长肠段活性下降，所以实验窗口较短。

（二）离体肝灌流技术

离体肝灌流技术是将肝脏的血液循环与全身分离，通过肝血管灌流药物，分析肝内药物转运和代谢，常用的动物有大鼠和犬。实验方法是将门静脉作为灌流液入口，肝静脉作为灌流液出口，与泵相连构成环路；将药物加入灌流液，开始灌流，不同时间测定灌流液和胆汁等药物和代谢产物浓度以评价药物在肝脏中的转运和代谢情况。例如，用大鼠离体肝灌流研究显示，OATPs抑制剂利福平可浓度依赖性地显著增大阿托伐他汀的AUC，胆汁分泌清除率同步降低，揭示了利福平与他汀类药物肝脏摄取相互作用的核心机制。

（三）其他原位/离体模型

脑灌流模型通过直接向通往脑部的颈动脉灌注含受测物质的灌流液，测定进入脑内药量，计算相关参数，分析药物脑部转运特征。离体肾灌流用于研究药物的肾清除，以及药物转运体在药物肾脏清除中发挥的作用。也可利用精切片技术研究转运体介导的药物转运。

四、在体模型

体外和原位模型积累的数据，最终都要经历在体验证。在体模型能整合全身系统性因素，是药物转运体研究的"黄金标准"，也是向临床推断最重要的桥梁。

药理学抑制模型是较快验证转运体体内作用的方式之一。其基本思路是在动物体内给予相对选择性的转运体抑制剂，在药理学层面暂时降低目标转运体功能，再观察受试药物药代动力学参数的变化。需要注意的是，许多抑制剂并不具有绝对选择性，因此实验设计和结果解释应充分考虑脱靶效应和多转运体共同抑制的可能。例如 GF120918（elacridar）常被视为 P-gp/BCRP 双重抑制剂，而不宜简单表述为单纯 BCRP 抑制剂。若合用后药物暴露升高，还需结合基因敲除动物、转染细胞实验或特异性探针底物进一步判断具体转运体贡献。

转运体基因敲除模型则更彻底。目前已有Abcb1a/b敲除、Bcrp1敲除、Mrp1/2/3/4敲除、Oct1/2敲除等一系列商业化小鼠可直接购买使用。这些工具鼠为研究转运体在ADME全过程中的作用提供了可重复的实验平台。以Bcrp1敲除小鼠为例，灌胃给予柳氮磺吡啶后，其AUC是野生型的117倍，鲜明展示了BCRP对口服药物吸收的"守门"作用。多重基因敲除鼠的开发更为研究多个转运体协同作用提供了可能——研究表明，在Abcb1a/b与Bcrp1联合敲除的小鼠脑中，帕纳替尼的暴露水平远高于单一敲除鼠，说明P-gp与BCRP在血脑屏障处存在功能上的互补代偿。

人源化动物模型是连接传统动物实验与人体药代预测的重要工具。由于啮齿类动物与人类在转运体底物特异性、组织分布和表达丰度方面存在明显种属差异，直接将动物数据外推至人体时存在不确定性。人源化模型通过导入人源转运体基因，或在动物体内重建部分人源组织/细胞功能，可在一定程度上降低种属差异带来的偏差。目前已有多种人源化转运体动物模型被报道或用于研究，例如人源化 OATP1B1/OATP1B3、P-gp、BCRP、MRP2、PEPT1 等模型。此类模型可用于评价特定转运体对药物吸收、肝摄取、胆汁排泄、肾排泄或血脑屏障通透性的贡献，但其外推价值仍依赖于模型中人源转运体的表达位置、表达量及与人体生理环境的一致性。

五、药物转运体的成像技术新方法

如果说上述方法都是通过检测药物浓度来"间接推算"转运体活性，那么成像技术则实现了对转运过程的直接可视化——这恰好是前述方法的共同盲区，尤其是在人体组织中的实时研究。

体外成像方面，共聚焦显微镜和荧光显微镜已成功用于监测转运体荧光底物在亚细胞水平的分布动态。以P-gp研究为例，用激光扫描共聚焦显微镜检测罗丹明123、柔红霉素和阿霉素在P-gp高表达细胞内的分布，发现P-gp抑制剂维拉帕米不改变阿霉素和柔红霉素的细胞表面/内部比例，却会显著增加罗丹明123的胞内蓄积，说明这三种底物的转运机制并不完全相同。

PET（正电子发射断层成像）则将视野延伸到了活体乃至人体。通过放射性标记的转运体探针（常用¹¹C、¹⁸F标记），可以实时定量测定药物在组织中的摄取和分布。¹¹C-维拉帕米已成为评估血脑屏障P-gp功能的标准工具，相关研究揭示了P-gp功能随年龄增长而下降的规律：老年受试者杏仁核、岛叶和小脑中¹¹C-维拉帕米的分布容积，分别比年轻人高出30%、26%和25%，与此对应，转运速率常数k₂与年龄呈负相关。这一发现或许可以解释为何老年人更易出现某些中枢神经系统药物的蓄积中毒。

SPECT（单光子发射计算机断层成像）常用于肝胆转运体功能的临床评估，常用探针⁹⁹ᵐTc-甲溴菲宁经OATPs摄取入肝细胞后通过MRP2转运入胆汁，再经胆管进入小肠。与正常大鼠相比，Mrp2自然突变的EHBR大鼠肝脏中⁹⁹ᵐTc-甲溴菲宁的AUC显著升高，而胆汁或肠道内放射性排泄减少，直观展示了MRP2在胆汁分泌中的核心作用。

MRI属于非电离成像技术，对软组织分辨率高，通过钆类造影剂（如Gd-BOPTA，经OATP1B1转运）可评估肝脏摄取转运体功能。随着超顺磁性氧化铁等新型造影剂的发展，MRI在胃肠道和腹部脏器转运体研究中的应用前景也在不断拓宽。

六、总结

从上述方法体系可以看出，药物转运体研究并非依赖单一技术，而是遵循"由简至繁、由低生理相关性到高生理相关性"的递进逻辑，逐层积累证据。

第一阶段以膜囊泡法和细胞高通量筛选为主，目标是快速判断候选化合物是否与特定转运体存在相互作用，成本低、效率高，但生理相关性有限。

第二阶段采用Transwell转运实验、SCH模型或稳定转染细胞株，重点明确转运体类型、测定Km和Ki等动力学参数，为后续IVIVE建模提供定量基础。

第三阶段利用在体单向肠灌流、离体肝灌流等原位/离体方法，在接近生理状态的条件下获取体内外相关性数据，验证体外参数的可外推性。

第四阶段通过抑制剂处置动物、基因敲除鼠或人源化鼠等在体模型，在整体动物水平明确转运体对药物吸收、分布、排泄的实际贡献，并为临床DDI风险评估提供直接依据。

最终，PET、SPECT和MRI等成像技术将研究视野延伸至人体，通过放射性或磁性标记探针，在无创条件下实时量化转运体功能及其药物相互作用效应，是连接临床前研究与临床实践最为直接的桥梁。

需要指出的是，上述各阶段方法均存在内在局限：体外模型缺乏完整的生理环境；啮齿动物与人类在转运体底物特异性、组织分布丰度及对抑制剂的敏感性方面存在种属差异；基因敲除或转染操作可能引发其他转运体和代谢酶的代偿性改变，进而干扰对实验结果的解释。因此，转运体研究结果的正确解读，需充分考虑所用模型的固有局限性，并结合多层次、多方法的交叉验证，以确保向临床转化的可靠性。

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