Patchliner自动膜片钳系统下hERG试验最佳实践

hERG（human Ether-à-go-go Related Gene）基因编码的钾离子通道，是心肌细胞复极过程中延迟整流钾电流（Ikr）的主要组成部分。若药物抑制hERG通道，会导致Ikr减弱、复极延迟，表现为QT间期延长，进而有可能诱发严重心律失常（如尖端扭转型室性心动过速Tdp），甚至猝死，因此hERG试验是心脏安全性评价的重要组成部分。由于过去各大研究机构和药厂在进行hERG试验时，在刺激程序、记录温度等试验条件存在着差异，导致最终试验结果不同，浪费了大量的时间精力，因此ICH S7B Q&A提出了综合性离体致心律失常风险评估（comprehensive in vitro proarrhythmia assay, CiPA），一种心脏安全性评价的新策略，其中对hERG试验最佳实践条件（best practice）进行了详细的描述。

记录温度

Recording Temperature

hERG通道的功能与细胞膜流动性、离子跨膜扩散速率及通道蛋白构象稳定性等密切相关，而这些过程均对温度敏感。与室温条件相比，近生理温度（35-37℃）下通道开放概率变高，电流振幅变高，药物与通道的结合速度更快，亲和力更高。因此在GLP试验中选择近生理温度（35-37℃）可获得更为精准和接近人体的试验结果。Patchliner自动膜片钳系统采用的温控系统，在Pipette、MeasureHead和ChipWagon三个位置进行温度控制，能够精准控制在35-37℃范围内。

刺激程序 Protocol

部分药物与hERG通道的相互作用具有状态和频率依赖性，在不同的刺激频率和protocol下可检测到不同的试验结果。因此在GLP试验中，ICH S7B Q&A推荐刺激频率为0.2 Hz，即5 s/sweep；并使用带ramp的刺激程序，如下图，减少不同protocol带来的试验误差。

质量控制

Recording Quality

本次会议提高了员工技能和团队合作，各个部门的经理发表讲话，提出了每个部门的目在hERG实验过程中会遇到很多问题，如细胞初始电流过小，电流不稳定，串联电阻过大，漏电流过大，它们都会影响实验结果。如何选取高质量的细胞，记录到高质量且准确的数据是GLP实验过程中的一个难题，ICH S7B Q&A对记录细胞的初始电流、封接电阻、漏电流和输入电阻等重要指标进行了质量控制，只有达到要求的细胞产生的数据才会进行统计分析并汇报。标和规划。活动的开展提升了员工的专业水平，提高了工作效率和质量，这次活动对于工作的开展起到了积极的作用。

浓度确认

Recording quality

由于供试品配制过程可能存在误差、给药制剂的吸附性等问题，ICH S7B Q&A要求对给药制剂进行浓度确认，并在GLP实验中做到以下几点：

供试品给药制剂在制剂稳定性时间内使用；

给药前需对供试品给药制剂和阴性对照进行浓度检测，确保各浓度配制正确，阴性对照组不含供试品；

由于部分供试品给药制剂在塑料材质中存在吸附性的问题，对于手动膜片钳系统，需要检测灌流后给药制剂浓度，并在计算抑制率时进行校正；

对于Patchliner自动膜片钳系统，机械臂枪头可直接从装有给药制剂的玻璃瓶中吸取供试品，不存在灌流系统吸附问题；机械臂枪头内壁选用低吸附的材料，选用同材质的平行微孔板检测给药制剂浓度，若存在吸附则进行校正。

阳性对照与阴性对照

常用阳性对照：Terfenadine和Cisapride

浓度设置：ICH S7B Q&A要求20-80%抑制率之间选至少两个浓度，本机构选取5个浓度计算IC₅₀值形成自己的背景数据更为科学。

阴性对照：与供试品所用的溶媒成分保持一致。

去除细胞本底电流

Remove the Backgroud Current of the Cell

原理：HEK293细胞本身带有本底钾电流，E-4031作为特异性hERG通道阻断剂，超高浓度的E-4031可完全抑制hERG电流；

操作：先给予各浓度供试品或阳性对照，再给予超高浓度E-4031。Patchliner自动膜片钳系统在数据分析时可自动扣除HEK293细胞本底电流，得到最终的抑制率或IC₅₀。

试验结果

Primary Endpoint Measures

对于能够计算出IC₅₀值的供试品，IC₅₀图需包含以下几部分：

▪IC₅₀值

▪Hill Slope

▪ 95% CI

▪摩尔浓度与质量浓度

对于不能够计算出IC₅₀值的供试品：

即供试品在最高浓度下对hERG电流的抑制率不超过50%。需列出各浓度对hERG电流的抑制率，及选择该浓度为最高检测浓度的理由，如供试品溶解度限制或细胞毒性等。

在实验过程中严格执行该标准，将有助于减少不同实验机构、仪器设备导致的误差，提高实验结果准确性，避免不必要的浪费。天勤生物采用的Patchliner自动膜片钳系统与传统的手动膜片钳相比具有以下优点，能够更为严格的遵循ICH S7B Q&A的要求。

操作简便，降低技术门槛；

提高实验效率和通量：4通道同时记录；

减少人为误差，数据均一性高；

降低药物消耗；

药物浓度交换速度快；

噪声低，信号质量好。

参考文献

[1] ALVAREZ BARON C, THIEBAUD N, REN M, et al. hERG block potencies for 5 positive control drugs obtained per ICH E14/S7B Q&As best practices: Impact of recording temperature and drug loss[J]. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 2022, 117:107193.https://doi.org/10.1016/j.vascn.2022.107193

[2] ICH S7B: Safety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals. May, 2005

[3] ICH E14/S7B Q&As: Clinical and Nonclinical Evaluation of QT/QTc Interval Prolongation and Proarrhythmic Potential Questions and Answers. February, 2022

关于天勤生物

天勤生物成立于2009年，是一家以大动物试验为特色、聚焦新药研究与评价的CRO高新技术企业，为客户提供一站式创新药物研发服务，致力于以更短的实验周期、更高质量的研究报告加快新药上市进程。

▪ 强大的项目承接能力：已有近30000㎡符合GLP规范的实验室投入使用，在建实验场地约80000㎡，可开展基于猴、犬、兔、大鼠、小鼠、豚鼠等实验动物的试验研究；

▪ 国际接轨的体系：GLP实验室满足国内、美国FDA、欧盟OECD、澳洲TGA等GLP标准，并通过国际AAALAC完全认证；

▪ 顶尖专家团队：汇聚多位拥有20年以上项目经验的新药审评专家和资深GLP技术专家，确保技术方案及报告的科学性和规范性，同时骨干成员均在药代动力学与药理学以及毒理学领域拥有超过10年的丰富经验，保障项目的高质量执行；

▪ 丰富的项目经验：3000余项专题研究、300多个新药申报品种、100余项中外申报的品种通过中国CFDA/NMPA 、美国FDA和澳大利亚TGA的审批进入临床或上市申请。

关于天勤鑫圣

天勤鑫圣是天勤生物的全资子公司，是七个湖北省级实验室之一的湖北江夏实验室重要的组成平台。天勤鑫圣I期总面积为16000平方米，可开展符合NMPA、FDA和OECD GLP规范的小分子、大分子、ADC、细胞和基因治疗等药物的安全性评价、药代动力学研究、生物检测与毒性病理诊断分析等专业化的CRO服务，为生物医药企业、科研院所提供专业的一站式技术服务支持，加快创新药研发和转化的进程。