导读：“更高效、更经济、更安全，是我们用创新技术完善生物制药各个不同疗法制备工艺的基本理念。树立行业标杆，探索国内mRNA行业发展的标准化、国际化是我们的方向，也是我们的使命。”任雪芸如是说。
疫情反复，mRNA疫苗成行业焦点
疫情反复，全民协同的现状让我们再次把目光聚焦在疫苗的研发上。mRNA疫苗是将编码疾病特异性抗原的mRNA引入体内，利用宿主细胞的蛋白质合成机制产生抗原，从而触发免疫应答【1】。目前，BioNTech、Moderna和CureVac并称为全球三大mRNA疗法引领者，其中，BioNTech和Moderna在此次新冠疫苗研发中均处于研发前列。
现阶段，我国获批上市的疫苗主要为北京所、武汉所、科兴中维生产的灭活病毒性疫苗；康希诺的腺病毒载体疫苗以及近期刚刚获批的智飞生物的重组新冠蛋白疫苗。而从国内mRNA新冠疫苗研发进程来看，在新冠的催化下，国内相关部门反应相当迅速，科研高校以及mRNA的初创公司及疫苗龙头企业进行资源整合迅速进行攻坚已有突飞猛进的发展。目前沃森生物的一代mRNA疫苗已经进入3期临床，和蓝鹊生物联合研发的第二代广谱变异株mRNA疫苗也完成了全部临床前研究，进入临床试验申报阶段。
根据2022年3月7日，美国疾控中心在The Lancet-Infectious diseases上发表的mRNA疫苗在美国接种6个月内的安全性研究数据【2】，在接种2.98亿剂mRNA新冠疫苗（BNT162b2和mRNA-1273）的人群中，向VAERS系统共报告340522例不良事件，绝大部分不良反应为非严重不良事件（92.1%），而类似局部疼痛、疲乏和头痛等反应占比较小，并且症状持续时间短暂、程度轻微。另外值得一提的是，数据中的不良事件死亡率不等同于不良反应，受试者的死亡与药物反应并无直接关系【3】。这一数据良好的验证了mRNA疫苗的安全性。
而在有效性方面，辉瑞-BioNTech和Moderna两款mRNA疫苗开始获批应用以后，NEJM【4】和《柳叶刀》【5】等顶级期刊相继刊载了一些真实世界研究，其结果也验证了mRNA疫苗的高效性。
（图片来源：TheLancet-Infectious diseases）
稳定的安全性，便捷生产的高效性让mRNA疫苗在国内的运用成为一种可能。另一方面，mRNA技术不仅局限于新冠疫苗，肿瘤免疫、传染病、罕见病的应用让mRNA成为众多企业竞相追逐的理由之一。国内艾博生物、斯微生物等数十家企业开始布局，其中艾博生物的ARCoV已进入临床三期有望成为国内第一个获批上市的国产mRNA新冠疫苗。除了有自身mRNA技术积累的药企以外，侧重于mRNA生产完整解决方案的众多CDMO企业也枕戈以待，如何在龙争虎战的mRNA技术领域取得先机？如何在激烈竞争中脱颖而出？mRNA行业会直面哪些困难和挑战？《峰客访谈》栏目组这次有幸邀请到赛多利斯中国区技术应用负责人任雪芸女士围绕相关问题展开话题。
三年，从疫苗支持者到mRNA技术平台专家
赛多利斯是一家成立超百年的德国企业，伴随着生物创新药的不断突破，其作为生物制药解决方案提供者的经营理念和业务模式也在日益迭代。
事实上，赛多利斯早在三年前就已经开始了其在mRNA领域的技术布局。
任雪芸女士表示：“我们最早接触mRNA是与国外一个知名的mRNA公司合作的项目，于此同时国内的客户也开始联系我们。在多个国内外的项目合作之后，我们的技术团队就开始对工艺和产品进行升级和改良，可以在mRNA生产工艺上提供好的解决方案。”
基于前期的经验累积，赛多利斯于近期宣布推出了mRNA工艺解决方案。方案覆盖了从质粒制备，到mRNA的制备包括IVT反应，mRNA的超滤纯化以及LNP的超滤纯化等，再到原液的除菌过滤和储存，冻存和分装等一整套平台工艺方案。旨在迅速与国内客户形成深入技术合作，重现并持续优化这一整套mRNA的工艺解决方案。协助客户共同完善mRNA产业的工艺标准，推进产业化进程。
赛多利斯mRNA完整解决方案（图片来源：赛多利斯官网）
“除了Moderna和BioNtech mRNA疫苗的上市，伴随着国内mRNA赛道的火热，我们在各个不同领域的参与度都相当高。”任雪芸这样说道。据了解，国内mRNA行业与赛多利斯合作的企业多为正在考虑产业化和规模化的中期企业。而在全球市场，赛多利斯已经为数十家mRNA相关企业提供了技术支持，在业内处于领先水平。
难点、对策、赛多利斯的方案
mRNA的临床潜力已经超出了疫苗的范畴，扩展到其他先进的治疗方法，例如蛋白质替代、基因治疗和癌症免疫治疗。然而在生产工艺上，这项新兴火热的技术还需要经过时间的打磨。国内在工艺流程的把控、临床效果和副作用的研究上距离全球顶级水平还尚有一段距离。
据任雪芸介绍，对于mRNA这样一个新的技术领域来说，mRNA合成、捕获、精纯，到最后脂质体包裹这些工艺流程中都有着不小的难度。
“在质粒构建方面，小规模培养其实业内已经比较成熟，但是上升到工业级水平一系列的问题就会非常棘手。比如放大以后，质粒的产量及质量是不是还能跟小规模工艺表现保持一致？这跟后续的IVT反应，加帽反应，纯度乃至最后的安全性都紧密相关。”
除此之外任雪芸透露：“根据我们过往的经验，其实mRNA的有效性跟安全性与其纯度的关联度非常高。此外，现在一些质粒的CMO公司也非常关注质粒的纯度，高纯的质粒的工艺，以及后续mRNA的提纯。前期质粒的放大生产以及后续体外转录反应对纯度的把控才是mRNA工艺过程中的重中之重。除此之外，mRNA修饰、医药用途和递送技术中的专利问题也是需要考虑的因素”
这些工艺环节的难题如何克服？赛多利斯给出了一份答卷。
从小到大，实现精准高效开发
“以质粒为例，一开始我们就可以采用微型反应器来摸索大肠杆菌的发酵工艺，像我们的Ambr系列台式高通量生物反应器系统，覆盖15ml到250ml培养体积，这对质粒工艺研发来说，可以快速实现培养规模的工业级放大。另外，mRNA体外转录过程同样如此，作为非常重要且成本高昂的一个工艺步骤，很多客户在工艺没有摸清之前也不敢贸然上很大的规模，可以考虑在Ambr体系下以毫升级的规模来做探索，探索酶和试剂的添加比例、温度、反应时间、反应试剂配比等参数，以较少的成本快速探索到合适的转录工艺。我相信这是赛多利斯独有的一个高通量解决方案。”
关于IVT技术任雪芸补充到：“我们发现，几个上市的mRNA企业在IVT上用的一些技术，不太一样。有的公司是用混匀系统做的，有的是用反应器做的。其实两个不同的体系所能提供的工艺需求是一样的，都要温和搅拌，精确控制温度等。但从我们角度来讲，赛多利斯比较推荐用Biostat®STR一次性生物反应器。因为从我们的Ambr体系放大到到200L反应器，二者之间可以比较容易scale up 和scale down进行工艺的验证和优化。毫升级规模下，通过Ambr整合多个实验设计和数据分析软件，直接在Ambr上进行研究，就能找到相对较优的适合目前IVT反应的工艺，最后帮助客户快速筛选得到稳定的反应工艺并合理放大至生产规模。这样的搭配是我们的设计理念，目前也只有赛多利斯可以做得到。”
Ambr与DOE的搭配，从小到大的工艺流程让赛多利斯为合作伙伴提供了稳定、高效的工艺。除了出色的设计，赛多利斯在mRNA的合成、捕获、精纯、浓缩等环节上同样用心良苦，以点对点的方式解决潜在的问题。
结果出发，最大化工艺收率
mRNA分子的合成通常由线性化的pDNA通过体外转录（IVT）反应来合成得到。IVT反应需要一个DNA模板、核苷酸底物、聚合酶以及加帽酶。而不同mRNA结构的合成可能需要不同的条件，这可能与推荐的程序不一致。这些程序可能包括间歇性纯化步骤，以便优化生产力。在这一点上赛多利斯基于其色谱分析的开发经验能够表征工艺的每一个步骤从而优化IVT反应,对特异性产品也能做到最大限度提高生产效率。
任雪芸认为，mRNA的捕获和精纯环节是也是影响最终成果的关键因素。“纯化阶段，核酸物质跟传统的抗体蛋白是完全不同的分子结构，其中包括pDNA的提取跟纯化过程。这部分的分离纯化在生物制药领域本身就是一个难点。”水溶液中mRNA的大尺寸、不稳定性以及其与污染物的相似性，这些因素阻碍了其分离的有效性。除此之外，大规模纯化技术的不成熟也是限制捕获环节的要素之一。对此，赛多利斯的解决方案则是基于整体柱的高流速以及结合洗脱模式实现杂质的高效去除。在捕获环节的初筛后，赛多利斯利用目的分子与杂质的分子特性不同通过一系列整体柱技术如离子交换、反相或疏水作用有针对性的去除残留杂质，从而最大限度的提高收率。
除此之外，浓缩和换液步骤可有效减少样品体积并置换缓冲液体系，这可以在整个过程的不同阶段进行。在最后的步骤中，需要对纯化的mRNA进行超滤。在该环节，赛多利斯则利用的是伽马辐照的Hydrosart®超滤膜包，在配合浓度达40%的乙醇使用下可在各种低污染的操作条件下保证安全性和纯度。
潮起之时，机遇与挑战并存
Moderna 2021年mRNA疫苗185亿美元的营业额预示着mRNA未来的广阔市场。业界目前已充分认识到mRNA的应用潜力，国际医药巨头如辉瑞、礼来、GSK、赛诺菲等，以及国内较为知名的大型制药公司如恒瑞、石药、君实、康希诺等，都相继开展mRNA产品线相关布局。
任雪芸也表示：“mRNA除了新冠疫苗以外，给整个疫苗行业带来了新的发展起点。其中的关键是靶点，目前从人类健康事业相关的新病发病率来看，肿瘤还是一个难点。我们也已经看到mRNA在肿瘤疫苗上一些新靶点的发现报道出来了很好的疗效，这是一个很好的趋势。”
在如此大热的环境下，mRNA技术还呈现出另一项特点：平台化技术发展及延伸。在这一新赛道，不单单是初创的CDMO企业涌入，转型和新布局也成为许多CDMO、CRO企业的选择。在对未来无限遐想的同时，相伴相生的风险也需要纳入考量之中。任雪芸坦言：“虽然这个赛道现在很热门，其实还是有很多潜在风险。虽然有相关研究院所和企业在国内走的非常靠前但也走了很多弯路，要克服很多挑战，从这个角度来说，没有一个庞大的技术团队来面对挑战、寻找克服挑战的解决方案，这个赛道走下去是很难的。
对于这一崭新的赛道我们充满期待。但风险与收益并存，在快步进入的同时考量清楚自身优势与局限才是企业稳固发展的关键。
“但是不管怎么说，建立一个稳定可靠的工艺平台和有真正技术实力的技术团队是基础。赛多利斯拥有经验丰富的专家团队和成熟的平台方案，我们也会推出针对行业人士的培训课程。我们的最终目标就是和国内的mRNA创新力量一起让这个领域发展壮大。”任雪芸表示。
[1] K Karikó, Buckstein M , Ni H , et al. Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors: The Impact of Nucleoside Modification and the Evolutionary Origin of RNA[J]. Immunity, 2005, 23(2):165-175.
[2] Rosenblum HG,Gee J,Liu R,Marquez PL,et al.Safety of mRNA vaccines administered during the initial 6 months of the US COVID-19 vaccination programme:an observational study of reports to the Vaccine Adverse Event Reporting System and v-safe.Lancet Infect Dis.2022 Mar 7:S1473-3099(22)00054-8.doi:10.1016/S1473-3099(22)00054-8.Epub ahead of print.
[3] ICH指导办公室.ICH指导原则. (https://www.cde.org.cn/ichWeb/guideIch/toGuideIch/3/1)
[4] BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine in a Nationwide Mass Vaccination Setting.N Engl J Med 2021; 384:1412-1423.DOI: 10.1056/NEJMoa2101765
[5] Impact and effectiveness of mRNA BNT162b2 vaccine against SARS-CoV-2 infections and COVID-19 cases, hospitalisations, and deaths following a nationwide vaccination campaign in Israel: an observational study using national surveillance data.The Lancet.Published:May 05, 2021DOI:https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)00947-8
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