原研创新丨基于三代测序SMA携带者筛查方法学的临床效能评估

2024/12/11

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近日，由钦州市妇幼保健院龙驹教授牵头、贝瑞基因提供技术支持的一项三代测序临床研究成果以“Evaluating the clinical efficacy of a long read sequencing-based approach for carrier screening of spinal muscular atrophy”为题发表于Human Genomics期刊。结果显示，CASMA可以准确检测拷贝数变异、微小变异、结合两代家系区分“2+0”基因型，在SMA一线携带者筛查中具有良好的临床应用潜力。

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脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉疾病，其特征是脊髓前角运动神经元变性和丧失导致的肌肉无力和萎缩。SMA的发病率约为1/10000，人群中的携带率约为1/50。SMA的致病基因是SMN1 基因，位于5号染色体上。SMN1 基因有个高度同源的修饰基因SMN2 ，SMN2 影响疾病的严重程度和进展。两者序列仅存在5个碱基差异，可通过第7外显子的c.840C/T位点进行区分。SMA疾病严重，早期治疗可改善SMA患者的运动功能和预后，但药物价格昂贵，且不能治愈。因此，对育龄夫妇进行携带者筛查和产前诊断，是防控SMA患儿出生的有效措施。

约95%的SMA携带者的基因型为SMN1 第7外显子的杂合子缺失。因此，SMA携带者的基因检测主要集中于SMN1 第7外显子的拷贝数。目前，多重连接探针扩增（MLPA）和荧光定量PCR（qPCR）是检测SMN1 拷贝数最常用的方法。MLPA和qPCR都是基于探针法的原理，由于第7外显子只有一个核苷酸差异，很难准确区分SMN1 和SMN2。特别是一个典型的复杂结构变异，一些个体在同一染色体上有两个顺式排列的SMN1 基因。携带这种变异的个体被称为沉默的“2+0”携带者，当他们的配偶也是SMA携带者时，他们就有生育患儿风险。

该研究采用MLPA和qPCR两种方法检测了1400个样本中SMN 基因的拷贝数，比较了两种方法结果的一致性。并采用基于长读长测序技术全面检测SMA的方法（CASMA），将CASMA结果与前两种常用的检测方法进行比较，探索和分析SMA携带者筛查的临床效能。

CASMA与MLPA、qPCR

检测结果一致

从676例MLPA和qPCR检测结果一致的阳性样本中，随机选取44例样本进行CASMA检测。对于SMN1 和SMN2 的第7外显子，CASMA的检测结果与MLPA和qPCR的检测结果一致。

在所选样本中，有13例样本SMN1 外显子7和8的拷贝数不一致（YZ32- YZ44）。根据CASMA结果显示，SMN1 和SMN2 发生了转换，其中11例样本中的转换区域为第8外显子（YZ33- YZ43，图1c和1D），1例样本中的转换区域包括部分第7内含子和第8外显子（YZ32。图1E）。1例样本中，MLPA探针结合区域有一个c.*237_*238del变异，MLPA结果显示SMN1 第8外显子拷贝数为1，而实际应该为2（YZ44，图1F）。

图1 MLPA和CASMA检测 SMN1外显子7和8拷贝数不一致的样本

CASMA鉴定MLPA、qPCR

不一致结果

对于SMN1 第7外显子，有16例样本MLPA和qPCR检测结果不一致，结果不一致的样本用CASMA进行检测，并重新采样进行MLPA和qPCR检测。除了1例样本CASMA检测出SMN1 基因c.-39A>G变异（图1B），其余样本两种方法第二次检测结果与CASMA检测结果一致。

有10例样本的定量不一致与SMN1 外显子7拷贝数重复（三个或四个拷贝）有关，其中6例样本的MLPA和qPCR结果位于阈值边界而误判，另外4例qPCR结果为拷贝数重复的假阴性结果。对于杂合缺失变异（一个拷贝），MLPA没有检测到假阴性或假阳性结果，而qPCR检测到6个假阳性结果。

SMA拷贝数结果统计

本研究中，SMN1 第7外显子在1、2、3和4个拷贝的频率分别为1.64%、93.79%、4.43%和0.14%。SMN2 第7外显子的0、1、2和3个拷贝的频率分别为4.71%、36.57%、55.50%和3.21%。

共检出23例SMA携带者，携带率为1/61，检出率为1.64%。检测到14例SMN1 缺失携带者（1.00%），4例基因型为SMN1:SMN2=1:1，10例基因型为SMN1:SMN2=1:2。检测到9例由SMN1 转化为SMN2 的携带者（0.64%），基因型为SMN1:SMN2=1:3。未检测到基因型为SMN1:SMN2=1:0的携带者。

CASMA两代家系

区分“2+0”基因型

在疑似SMA患者的基因诊断中，收集到一个家系。先证者的SMN1 基因纯合缺失，先证者母亲的SMN1 基因杂合缺失，先证者父亲的SMN1 基因拷贝数为2。因此，先证者的父亲疑似为“2+0”基因型。由于缺少先证者祖父母的样本，无法通过三代连锁分析来确定先证者父亲的基因型。

CASMA可以通过SMN1/2 基因全长序列的SNP数据进行单倍型分析，通过两代人的单倍型分析，来鉴定“2+0”基因型，因此选取该家族中三个样本（I-1、I-2和II-2）进行家系分析。

根据CASMA单倍型分析结果（图2），II-2的两个SMN1 拷贝均遗传自其父亲，II-2和他的父亲I-1均是SMN1“2+0”基因型。II-2的两个SMN2 拷贝都是遗传自他的母亲的，II-2和母亲均为SMN2 “2+0”基因型。与传统的基于PCR的基因检测方法相比，CASMA可以通过仅对父母和一个孩子进行基因分型来确定“2+0”基因型。

图2 家系图及CASMA分析

本研究对60例样本进行了CASMA检测，对于MLPA和qPCR结果一致的样本，CASMA结果一致性为100%，并直观地解释了MLPA外显子7和8拷贝数的不一致情况。对于MLPA与qPCR结果不一致的样本，CASMA避免了样品质量、实验操作、数据分析等因素对结果的影响，得到了更准确的结果。因此，根据CASMA校正的MLPA/ qPCR检测结果，SMN1 和SMN2 在选定群体中的携带率和拷贝数分布更接近真实情况。“2+0”基因型作为一种特殊类型的携带者，在普通人群中的携带率约为5%~8%。MLPA和qPCR等定量基因检测技术可以检测SMN1 和SMN2 基因的拷贝数，但它们不能区分“2+0”基因型和正常的“1+1”基因型。CASMA通过二代家系检测，即可区分“2+0”基因型。

综上所述，CASMA不仅可以量化SMN 基因的拷贝数，而且可以准确地检测基因内变异，并且可以更容易的鉴定受试者的“2+0”基因型。这是一种简单、准确的SMA筛查方法，在大规模筛查SMA中具有较大的临床效能。

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