siRNA药物非临床安全评价策略

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siRNA是长约20-25个碱基对的双链RNA分子。进入细胞后，其经内吞体进入细胞质，被RNA诱导沉默复合体（RISC）捕获。Argonaute（AGO）蛋白解离正义链，反义链引导RISC通过碱基互补配对识别并切割靶标mRNA，从而特异性抑制基因表达。该过程高效持久，极少拷贝即可实现有效的基因沉默。

图1 常见的寡核苷酸平台

siRNA的递送策略主要可分为病毒递送系统与非病毒递送系统两大类。

病毒递送系统（如逆转录病毒、慢病毒及腺病毒）具有细胞转染效率高的优点，但其应用面临一系列挑战，包括预存免疫、引发宿主免疫反应、潜在的不良后果、病毒基因组整合风险以及安全载体的高昂成本。

非病毒递送系统主要分为配体缀合与封装两种策略。配体缀合策略通过将siRNA与胆固醇、脂质、抗体或糖蛋白（如N-乙酰半乳糖胺，GalNAc）等靶向分子共价连接，可实现靶向递送并促进内体逃逸；其主要缺点在于裸露的siRNA易受核酸酶降解，且可能被宿主免疫系统识别。封装策略则利用各类纳米载体包封和保护siRNA，常见类型包括脂质体与脂质纳米颗粒（LNPs）、胶束、聚乙二醇（PEG）修饰的纳米颗粒（NPs）、树状大分子，以及金属/金属氧化物纳米颗粒、碳纳米管等。该策略能有效提高siRNA的稳定性和递送效率。

临床试验分析显示，当前siRNA疗法在遗传病、肝病等领域探索活跃，皮下注射与共轭连接是主要的给药途径和递送策略。

表1 siRNA药物与其他药物类别的特性比较

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siRNA药物的非临床评价需置于寡核苷酸药物的整体监管与科学框架下进行。其策略借鉴了该类药物的共性指导原则，并针对siRNA的双链结构、递送系统及特定作用机制进行定制化设计。

主要遵循ICH系列指南，如S6(R1)、M3(R2)、S8等，以及美国FDA、日本PMDA发布的指导原则，行业共识（如寡核苷酸安全性工作组，OSWG）文件为遗传毒性、免疫毒性等评价提供了重要补充建议。

表2 寡合苷酸药物常见指导原则及行业共识

寡核苷酸药物（包括siRNA）的毒性可分为杂交依赖性和非杂交依赖性两类，评价时需区分共性风险与序列/结构特异性风险。

此外，具有相似结构及物理/化学性质的某一类寡核苷酸药物可能表现出共同的毒性特征，例如引起APTT延长、补体系统激活、免疫刺激以及肝、肾毒性等。这些共性毒性信息可为同类寡核苷酸药物的开发提供重要的参考依据。

给药方式及递送系统载体也影响寡核苷酸药物的毒性。例如，基于LNP或通过GalNAc偶联的siRNA，能够高效靶向肝脏等器官。然而，也正是由于在这些组织中暴露水平较高、作用时间相对持久，容易造成药物蓄积，从而引发相应的毒性反应。

siRNA药物的非临床研究策略强调整合性，旨在避免不必要的动物试验。其设计要点在于种属选择（必须使用药理学相关种属，必要时采用替代分子策略）以及对递送系统潜在毒性的充分评估，所有试验的设计与评价均需严格遵循ICH等国际指导原则。

表3 siRNA药物非临床研究的各项试验及其策略

寡核苷酸药物的非临床研究需系统开展多项其他专项毒性评价，其具体研究内容及依据如下：

表4  siRNA药物非临床研究其他试验项目

siRNA的ADME特征显著区别于小分子，其吸收主要依赖于皮下或静脉给药途径。血浆半衰期通常较短，但在靶组织中的半衰期显著延长，可达数周至数月。

代谢过程主要由核酸外切酶和/或内切酶介导，代谢速率与寡核苷酸特定的化学修饰结构密切相关。在药物相互作用层面，该类分子通常不是细胞色素P450酶或常见转运体的底物、抑制剂或诱导剂；但需注意，其通过调节靶向mRNA可能影响上游生物过程，从而间接调控包括某些CYP酶在内的蛋白表达。

分布上，该类药物表现出明显的组织器官靶向性，主要分布于肝脏、肾脏、淋巴组织及注射部位，并在血浆中与蛋白结合。排泄途径主要通过肾脏完成，具体机制涉及从毛细血管或细胞囊泡中渗漏或释放进入原尿。需特别指出，经过化学修饰的寡核苷酸在动物体内的完全清除过程可能长达数月。

如果包含新的递送系统或化学修饰，则应按照 ICH M3（R2）中规定的时间节点提供来自试验、产品特异性表征的数据以支持临床开发。对于体内 ADME 评估，给药途径应与预期的临床给药途径相关。对于偶联或ONTs制剂，应测试临床药物产品或类似制剂。应确定临床制剂和非临床评估中使用的制剂之间的任何差异并证明其合理性。

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Patisiran（商品名Onpatiro®）是于2018年获FDA批准的首款siRNA药物，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）。该药物的推荐剂量为0.3 mg/kg（对于体重≥100 kg的患者，每次给药30 mg），通过静脉输注给药，每三周一次。其活性成分为一条19个碱基对的siRNA双链，通过LNP系统包裹并靶向递送至肝脏。该LNP载体中包含两种新型脂质组分。在非临床安全性评价中，猴被确定为该药物的敏感动物种属。

表5 siRNA药物Patisiran非临床安全性评价研究概览

Vutrisiran（商品名Amvuttra®）是2022年获FDA批准的第五款siRNA药物，用于治疗hATTR。该药物采用皮下注射给药，每三个月一次。其作用机制依赖于与GalNAc共价连接，该结构能被肝细胞表面的唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）特异性识别，从而实现药物向肝脏的靶向递送。进入肝细胞后，Vutrisiran通过RNA干扰机制降解TTR mRNA，进而降低血清及组织中的TTR蛋白水平。在非临床安全性评价中，猴被确定为该药物的敏感动物种属。

该药物在食蟹猴中完成PK/PD及安全性验证，开展了全面的毒理学评价研究，包括重复给药毒性（大鼠和猴）、生殖与发育毒性以及遗传毒性评估。GalNAc递送系统展现了优异的肝脏靶向性和安全性特征。

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siRNA药物的非临床安全评价是一项系统工作，需结合寡核苷酸药物的共性与siRNA的个性化特征来综合评判。

种属选择需综合评估药效学、药代动力学及毒理学三方面的相关性。针对靶向毒性的研究，通常应选择一种或两种具有药理学活性的相关动物种属。若缺乏药理学相关种属，则可在一个种属中采用替代分子进行毒性评估。啮齿类动物最常选用大鼠，偶尔使用小鼠。该类动物通常对炎症反应及免疫刺激的敏感性高于非人灵长类动物。非啮齿类动物 目前最常用猴，因其靶向mRNA序列与人具有较高的同源性，药效活性与人相关，且在补体活化、促炎作用的敏感性以及药代动力学特征方面与人体较为相似，积累了相对丰富的安全性及药代数据。

遗传毒性评估通常需开展一套标准的组合试验。该组合包括Ames试验、哺乳动物细胞染色体畸变试验（或小鼠淋巴瘤基因突变试验）以及体内微核试验。生殖与发育毒性试验开展的具体时间节点和试验内容应参考ICH M3(R2)和S5(R3)指导原则。研究中需注意提高给药频率，以确保在子代离乳前的关键发育阶段，能够维持足够且持续的母体药物暴露以及胎盘药物暴露水平。致癌性试验的必要性、设计及剂量选择可参考ICH S1系列指导原则，其策略与小分子药物类似。

此外，需考虑药物特定的特殊毒性。例如，基于其特定的给药途径，可能需要开展刺激性试验及体外溶血试验。最终的风险评估应综合考虑产品自身特性（如化学修饰、递送系统）以及临床拟用情况（如适应症、给药方案），遵循具体问题具体分析的原则，进行全面的风险获益综合评价。

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