ACS Nano丨IF=15.8人血小板裂解液培养基有望替代传统的胎牛血清推动间充质干细胞源外泌体MSC-EVs临床转化！

MSC-EVs在再生治疗领域极具潜力，但传统上应用胎牛血清（FBS）作为常用培养补充剂，其含有的异种成分阻碍了MSC-EVs的临床应用。HPL被视为FBS 的潜在替代物，然而HPL作为MSCs培养基产生的EVs是否适合临床转化尚不明确。

近日，东南大学附属中大医院肾脏内科刘必成教授和吕林莉教授团队在国家自然科学基金重点项目和国家优秀青年基金等资助下，全面系统地比较了HPL和FBS对MSCs-EVs产生和性能的影响，并在国际知名期刊ACS Nano（《美国化学学会纳米杂志》，IF 15.8）在线发表研究论文，题为“Comprehensive Comparison of Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells Cultured with Fetal Bovine Serum and Human Platelet Lysate”，这一成果聚焦评估人血小板裂解液（HPL）培养基对间充质干细胞源外泌体（MSC-EVs）产量、质量和功能属性的影响，有望推动MSC-EVs临床转化。本文第一作者为张玥博士和宋静博士，通讯作者为刘必成教授、吕林莉教授和汤涛涛副研究员。恩泽康泰提供Exosupur细胞上清排阻柱ES914+外泌体多组学(全转录组+蛋白质组)。

研究内容及结果

评估MSC-EV的前提是确保母细胞的良好细胞状态。作者先对含有FBS和HPL的培养基对MSCs的关键质量属性和生物活性的影响进行了全面比较。结果发现，第3代FBS和HPL培养的MSCs均表现出成纤维细胞样形态、三系分化能力和典型MSC表面标志物的高表达（图1A-C）。然而，在相同的三系诱导分化期内，与FBS培养的MSCs相比，HPL培养的MSCs显示出更强的分化为骨细胞和脂肪细胞的能力（图1B）。值得注意的是，FBS的长期培养导致从第8代开始细胞大小增加，群体倍增时间（PDT）显著延长至100小时以上（图1D）。相比之下，这些变化在HPL培养的MSCs中延迟，仅在第12代后才变得明显。在第6代，与用FBS培养的MSCs相比，HPL培养的MSCs表现出显著更高的细胞存活率、更短的群体倍增时间和更高的ATP表达（图1D-F）。此外，HPL培养的MSCs表现出类似的低凋亡率（<5%）和较低的β-半乳糖苷酶活性（图1G，H）。总之，HPL保持了关键的质量属性，增强了MSCs的生物活性，使其成为FBS的有利替代品。

图1：FBS和HPL培养条件下MSCs的特征

（A） 第3代MSCs的形态学表征

（B）MSCs在同一天诱导后第3代的三系分化（n=3）

（C） 流式细胞术检测第3代MSCs表面抗原表达（n=3）

（D） 群体倍增时间（h）用于测量第1-12代MSCs的增殖率

（E） 第6代MSCs的细胞存活率（n=6）

（F） 第6代MSCs的代谢活性（ATP浓度/蛋白质）（n=3-5）

（G） 流式细胞术检测MSCs凋亡率（n=3）

（H）β-半乳糖苷酶染色显示MSCs在第6代时衰老；β半乳糖苷酶阳性细胞的代表性图像（左图）。衰老细胞的平均百分比如图所示（右图）。（n=5）。与FBS组相比，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。

为了全面评估FBS和HPL培养的MSCs来源的MSC-EV（F-EV和H-EV），作者设计了一种实验方法，如图2A所示。随着MSCs传代的增加，尤其是在观察到第8代之后，EV粒径增大，产量降低；因此，作者选择第6代MSCs进行EV表征。在物理特性方面，结果显示，通过三种不同的EV尺寸分布方法（NTA约150 nm；Exoview约60 nm；nanoFCM约80 nm）检测到的F-EV和H-EV的平均尺寸没有显著差异（图2B）；透射电子显微镜（TEM）图像显示F-EV和H-EV之间存在类似的杯形形态（图2C）。此外，F-EV和H-EV都表达了常见的EV表面标志物（CD9、CD63和TSG101），并且没有显示出细胞污染的证据（Calnexin）（图2D）。为了进一步量化具有相同颗粒数的F-EV和H-EV上标记蛋白的表达，ExoView芯片显示，CD63抗体捕获的EV最丰富，其次是CD81捕获的EV，在F-EV和H-EV之间没有观察到显著差异（图2E）。尽管与F-EV相比，H-EV中CD9抗体捕获的EV的表达更高，但其所占比例很小（图2F）。根据ISEV的要求，本研究中MSC-EV的纯度超过1×10⁸个颗粒/μg，以确保研究质量（图2G）。重要的是，基于HPL培养条件下MSCs的良好细胞状态，在相同体积的培养基下，H-EV的产量比F-EV高1.5倍（图2H），来自单细胞的EV产量增加了1.2倍，但没有观察到显著差异（图2I）。就免疫抑制特性而言，H-EV对T细胞增殖具有抑制作用。总的来说，与FBS相比，HPL培养条件不仅保持了关键的质量属性，还促进了MSC-EV的生产。

图2：来源于FBS和HPL培养条件的MSC-EV的特征

（A）MSC-EV制备和分析实验设计示意图。HUC：人脐带；WJ：Wharton's jelly华通氏胶；FBS：胎牛血清；HPL：人血小板裂解液；CM：条件培养基；UC：超速离心；SEC：尺寸排阻色谱法；F-EV和H-EV：来源于在含有FBS和HPL的培养基中培养的MSC的EVs

（B）使用NTA、NanoFCM和Exoview测量的MSC-EV的平均大小（n=4）

（C）MSC-EV的TEM图像。比例尺显示500和100 nm

（D）MSC-EV中EV表面标志物（CD9、CD63、TSG101）和内质网相关蛋白（Calnexin）的蛋白质印迹分析

（E，F）Exoview显示F-EV和H-EV上存在CD9、CD63和CD81。结果以芯片上三个不同点的平均值±标准差表示。用NTA测定囊泡的浓度，并将109个颗粒加入芯片中（n=4）

（G）使用NanoFCM测量的MSC-EV颗粒和使用微孔板检测器测量的蛋白质计算的纯度（颗粒/μg）（n=4）

（H，I）通过NanoFCM测定的48小时间隔内F-EV和H-EV的产量，并归一化为条件培养基体积和细胞数量（n=4）

（J） 通过CFSE标记PBMC和用CD3和CD28抗体激活T细胞，分析MSC-EV对T细胞增殖的影响（n=3）与F-EV组相比，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

为了进一步阐明这些差异的功能意义，作者使用多组学测序来表征MSC-EV的内容物，包括miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA、蛋白质、亲水性代谢物和脂质。首先，就种类和丰度而言，F-EV和H-EV中种类最多的是mRNA，其次是lncRNA和蛋白质。与F-EV相比，H-EV中的mRNA种类减少（F-EV 11215和H-EV 10323），而其他成分没有显著差异（图3A）。RNA丰度分析表明，在F-EV和H-EV的小RNA中，rRNA和tRNA的丰度最高，与F-EV相比，H-EV的tRNA丰度较高，rRNA丰度较低。mRNA在长RNA中最为丰富，在F-EV和H-EV中没有显著差异（图3B）。此外，为了呈现FBS和HPL培养条件下EV的总体分布趋势，主成分分析（PCA）显示F-EV组和H-EV组的miRNA、蛋白质和mRNA明显分离，表明两组之间存在差异（图3C）。有趣的是，与F-EV组相比，H-EV组在所有成分的四个样本中显示出更突出的聚类，表明单个样本内的相似性更大（图3D）。对前50个表达成分的重叠分析还显示，与F-EV相比，HPL EV的四个样本在miRNA、mRNA、蛋白质、lncRNA和脂质方面的重叠程度更高（图3D）。这些结果证实了H-EV具有更高的货物稳定性。此外，差异聚类分析表明，F-EV和H-EV之间的差异成分主要存在于蛋白质（38.58%）、脂质（16.69%）、miRNA（9.28%）和mRNA（5.91%）中（图3E），与PCA的结果一致。

图3：FBS和HPL培养条件下MSC-EV的货物异质性

（A）通过多重分析在F-EV和H-EV中鉴定的成分种类数量

（B）MSC-EV中每种RNA物种的丰度，分别分析小RNA和长RNA数据

（C）PCA图显示了MSC-EV样本的分布，其中每个数据点代表数据集中的一个观测值。图的X和Y轴表示前两个主成分，它们捕获了数据中的最大可变性。蓝色和红色分别代表F-EV和H-EV

（D）维恩图显示了来自四个供体的MSC-EV成分之间的交集和差异

（E）差异基因表达分析显示了所有七个簇中H-EV的上调和下调成分。调整后的p值<0.05用红色表示，调整后的p值≥0.05用黑色表示

为了研究F-EV和H-EV之间的差异成分是否有助于MSC-EV治疗功能的变化，作者整合了F-EV和H-EV中差异表达成分的功能信息，重点研究了上调和下调的蛋白质、mRNAs、miRNAs和lncRNA及其靶基因。基因本体论分析GO富集分析显示，H-EV上调的mRNA在几种再生相关的生物过程中表现出富集，包括血管生成的正向调节、凋亡的负向调节和细胞增殖的正向调节（图4A）。而下调的mRNA与生物过程有关，包括炎症反应的正向调节、NF-κB转录因子活性的正向调节和细胞生长的负向调节。同样，基因集富集分析（GSEA）也表明，H-EV上调的mRNA参与促进生长和发育，而下调的mRNA与促进炎症反应有关（图4B）。H-EV中上调的蛋白质在几个重要的生物过程中富集，包括细胞信号传导、免疫反应调节和组织发育，而下调的蛋白质与多种免疫反应相关的信号通路有关，如NF-κB、IL-1和IL-12（图4C）。此外，miRNA和lncRNA的靶基因与包括血管生成、细胞增殖、凋亡和免疫反应调节在内的生物过程有关（图4D，E）。有趣的是，多组学的功能富集分析一致性地强调了与血管生成相关的多种生物过程。此外，GO和KEGG数据库还显示，H-EV上调成分中的血管生成相关途径显著富集。总之，对H-EV上调成分的功能分析表明，可能增强治疗潜力，尤其是血管生成。

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图4：F-EV和H-EV之间差异表达成分的功能分析

（A，B）基于H-EV中上调和下调的mRNA的GO富集分析和GSEA分析

（C）基于H-EV中上调和下调表达蛋白的GO富集分析

（D，E）基于H-EV中miRNA和lncRNA靶基因的GO富集分析

为了验证H-EV与F-EV在血管生成方面的差异，作者检测了MSC-EV中与血管生成相关的mRNA和miRNA载体。对文献和GO数据库中涉及血管生成的代表性基因进行了重叠分析，这些基因在H-EV中具有高表达的miRNA和mRNA成分。然后通过RT-qPCR选择15种miRNA或mRNA进行验证。结果显示，所有核酸都在MSC-EV样本中表达，尽管它们的水平各不相同。在F-EV和H-EV中，基质金属蛋白酶2（MMP2）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）是与血管生成相关的最丰富的mRNA。与F-EV相比，H-EV中MMP2、血小板衍生生长因子受体B（PDGFRB）、血管内皮生长因子B（VEGFB）、血小板衍生增长因子D（PDGFD）、肝细胞生长因子（HGF）和MMP14的表达增加了5倍以上（图5A）。在F-EV和H-EV中，miR-378-5p和miR-409-3p是与血管生成相关的最丰富的miRNA（图S4B）。与F-EV相比，H-EV中miR-181b-5p、miR199b-5p，miR-409-3p、miR-210-3p、miR-126-3p、R-181a-5p和miR-378-5p的表达增加了5倍以上（图5B）。接下来，功能检测表明，F-EV和H-EV都能促进人脐静脉内皮细胞（VEC）的管形成（图5C）。然而，与具有相同粒子数的F-EV相比，H-EV导致分支总长度和管数增加（图5D，E）。H-EV干预后，VEC的迁移能力高于F-EV（图5F，G），表明H-EV的血管生成能力更强。总之，HPL培养条件显著增加了MSC-EV中血管生成相关miRNA和mRNA的表达，从而增强了血管生成潜力。

图5：H-EV富含更多的血管生成相关分子，并表现出增强的血管生成作用

（A，B）RT-qPCR测定H-EV中血管生成相关miRNA和mRNAs相对于F-EV的折叠变化热图（n=3）

（C）用VEC中的F-EV或h-EV（106个颗粒/104个细胞）进行的基质凝胶管形成试验（2、4、6、8小时）的代表性图像

（D，E）使用ImageJ对计算机分析获得的网格数量和分支总长度进行定量分析（n=4）

（F）用F-EV或H-EV进行的迁移测定的代表性图像（108个颗粒/106个VEC）

（G） 使用ImageJ对迁移区域进行定量分析（n=3）。与F-EV组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。MMP2：基质金属蛋白酶2；血小板源性生长因子受体；VEGFB：血管内皮生长因子B；PDGFD：血小板衍生生长因子D；HGF：肝细胞生长因子；ITGA5:整合素α5；ANGPLT2：促血管生成素样蛋白2；ANGPT1：促血管生成素1；FGF2：成纤维细胞生长因子。

作者进一步探索了H-EV在肾缺血/再灌注损伤（IRI）小鼠模型中增强的血管生成能力。确定1×10¹⁰颗粒是H-EV促进血管生成的最佳剂量，然后比较了F-EV和H-EV对肾损伤的治疗效果，每24小时进行一次治疗，持续三次（图6A）。在IRI组中，双侧肾损伤导致血清肌酐和血尿素氮水平显著升高（图6B，C）。肾损伤指标（中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、Ngal和肾损伤分子-1、Kim-1）显示，肾IRI后mRNA表达增加（图6D、E）。PAS染色显示明显的肾小管间质损伤，包括肾小管坏死、铸型形成和炎性细胞浸润（图6F，G）。然而，通过F-EV或H-EV治疗，这些损伤参数得到了改善。令人印象深刻的是，H-EV在肾功能、病理损伤和肾损伤指标方面比F-EV有更显著的改善（图6B-G）。

接下来，为了确定F-EV和H-EV对肾血管生成的影响，对内皮细胞标志物（血小板内皮细胞粘附分子-1，Pecam-1/CD31）和增殖标志物（增殖细胞核抗原，PCNA）进行了联合免疫染色。F-EV和H-EVs治疗组缺血/再灌注（I/R）诱导的肾毛细血管稀疏明显改善。与F-EV相比，一致观察到H-EV治疗增加了PCNA和CD31的共表达，表明内皮细胞增殖增加（图6H）。然后使用RNA测序来检查四组的转录谱，以确定F-EV和H-EV之间治疗效果差异背后的血管生成机制。显示的热图显示，MSC-EV，尤其是H-EV，逆转了I/R损伤引起的基因表达改变（图6I）。H-EV的mRNA上调，富含参与血管生成的多种生物途径，包括后肾肾小球毛细血管形成、肾小球内皮发育、血管伤口愈合、肝细胞生长因子受体信号通路、内皮发育、发芽血管生成、血管重塑和血管生成的正向调节（图6J）。

此外，作者还评估了体外缺氧条件下EV对VEC的影响。在共聚焦荧光显微镜下与VEC孵育后，使用细胞膜红色荧光探针（DiD）标记的EVs追踪亚细胞定位。在缺氧/复氧（H/R）损伤的细胞中检测到DiD标记的F-EV和H-EV的内化（图7A）。缺氧导致VEC存活率降低，PCNA表达增加（图7B，C），凋亡增加（图7D）和活性氧（ROS）产生增加（图7E）。经VEC治疗F-EV和H-EV后，上述损伤得到改善。与F-EV相比，H-EV可以显著提高VEC中的细胞存活率和PCNA表达（图7B，C），减少凋亡和ROS产生（图7D，E），表明损伤和再生得到改善。

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图6：H-EV在体内显示出增强的血管生成作用

（A）实验设计示意图。简而言之，在双侧肾缺血26分钟后0、24和48小时，给小鼠服用磷酸盐缓冲盐水（PBS）、F-EV或H-EV

（B-E）RT-qPCR检测肾组织中血清肌酐和血尿素氮水平以及Kim-1和Ngal的mRNA表达（n=7）

（F）PAS染色肾组织的代表性图像(n=7)

（G）肾小管损伤的半定量(n=7)

（H）CD31和PCNA荧光染色的代表性图像

（I）热图显示肾组织中mRNAs的差异表达(n=4)

（J） 基于I/R+H-EVs组上调的mRNA的GO富集分析。*/#/+p<0.05，**/##/++p<0.01，***/###/+++p<0.001，****/####/++++p<0.0001。+：与假手术组相比，*：与I/R组相比，#：与I/R+F-EVs组相比。

图7：H-EV在体外显示出增强的血管生成作用

（A）荧光图像显示DiD标记的EV在缺氧VEC中积聚

（B）在正常或缺氧条件下用MSC-EV处理的VEC的细胞存活率，用细胞计数试剂盒测量（n=4）

（C）VECs中PCNA表达的蛋白质印迹分析（n=3）

（D）用MSC-EV处理的VEC的凋亡（109个颗粒/106个细胞）（n=3）

（E）MSC-EV治疗VEC的代表性图像和ROS评估分析（n=4）*/#/+p<0.05，**/#/++p<0.01，***/###/+++p<0.001，****/####/++++p<0.0001。+：与常氧组相比，*：与缺氧组相比，#：与缺氧+F-EVs组相比。

研究结论

该研究发现，（1）HPL培养条件为MSC-EVs生产提供良好的母细胞状态（MSC呈现高活力、快增殖及低凋亡衰老特性）。（2）促进EVs产生，保障关键质量属性。两者在平均粒径、形态、表面标志物表达和免疫抑制等关键质量属性上无显著差异。而重要的是，HPL培养条件下的EVs产量比FBS显著增加。（3）多组学分析显示不同脐带来源的H-EVs样本组成相似性更高，货物稳定性更强。（4）该研究对H-EVs和F-EVs的主要差异组分进行功能分析发现，H-EVs在促进再生特别是促进血管生成方面表现卓越。研究者们发现，H-EVs中多种促血管生成的mRNA和miRNA表达显著增加。体外实验中，H-EVs能促进人脐静脉内皮细胞成管并增强其迁移能力。在小鼠肾缺血/再灌注损伤模型中，H-EVs对肾功能、病理损伤和肾损伤指标的改善效果明显优于F-EVs，且能显著促进肾血管生成，增加内皮细胞增殖能力。

本研究核心发现示意图

该研究通过全面比较论证HPL和FBS对MSC-EVs产生、质量和功能属性，证实了HPL作为MSC培养基补充剂，可显著提高EVs的产量，增强其血管生成潜力，且不改变关键质量属性。该研究为运用HPL于临床级MSC-EVs的生产提供了有力证据，为推动MSC-EVs在再生医学中的临床转化提供了理论和实验依据。

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Zhang Y, Song J, Wang B, Wen Y, Jiang W, Zhang YL, Li ZL, Yu H, Qin SF, Lv LL, Tang TT, Liu BC. Comprehensive Comparison of Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells Cultured with Fetal Bovine Serum and Human Platelet Lysate. ACS Nano. 2025 Mar 20. doi: 10.1021/acsnano.5c02532IF: 15.8 Q1 . Epub ahead of print. PMID: 40110859IF: 15.8 Q1 .