Nature Medicine|这个指标作为临床试验的探索性终点

患者流程图如下，在数据截止日期，25名患者已停止研究治疗，停药的常见原因是疾病进展（n=22）。

图1

治疗相关不良事件（TRAE）：总体而言，该治疗安全且耐受性良好。27例患者（75.0%）观察到低级别TRAEs，无≥3级 TRAEs。3 例患者（8.3%）经历了需要全身性类固醇治疗的免疫相关不良事件（irAE）。

临床反应：36例患者中有3例（8.3%）达到完全缓解（CR），8名（22.2%）达到部分缓解（PR）。疾病控制率为55.6%（36例中的20例）（图2b-d）。图2a为临床试验设计。

图2

使用IFNγ酶联免疫吸附点（ELISpot）测定评估22例具有PBMC样本的患者在治疗前后是否存在疫苗诱导的新抗原特异性反应。在几乎所有患者中，治疗都与累积PTCV新抗原特异性 T 细胞反应幅度的增加有关（P < 0.0001）（图3a）。

PTCV治疗还与引发免疫反应的编码新抗原数量的增加有关。在 22 名患者中，有19 名（86.4%）在治疗后具有T细胞反应性的疫苗编码的新抗原数量高于治疗前（图3b）。治疗后PTCV编码的新抗原特异性T细胞应答表位中位数为64.0%，而治疗前应答表位为11.8%。PTCV免疫导致临床反应和无反应患者的阳性表位显著增加（图3c）。

然后通过在体外用患者特异性新表位池刺激的PBMC进行细胞内染色，在4名患者（1例CR，3例PR）的子集中确认了新抗原特异性反应。在新抗原刺激后，CD4⁺和CD8⁺群体都表现出增加的激活曲线（图3d）。布尔门控证实活性（CD69+CD107a+）的增加趋势（图3e）和具有溶细胞能力的多功能CD4⁺和CD8⁺ T细胞在刺激后增殖（Ki67+）（图3f）。这些数据表明，疫苗接种能够引发具有溶细胞潜力的多功能新抗原特异性CD4⁺和CD8⁺反应。

图3

对14名患者配对治疗前和治疗后PBMC和肿瘤活检样本进行bulk TCRβ测序。14名患者的外周血和肿瘤组织中均有显著的T细胞克隆扩增（图3g）。与治疗前相比，治疗后肿瘤内扩增的 T 细胞克隆的丰度和数量都有所增加，外周血中也一样（图3h、i）。治疗后肿瘤中TCR克隆性显著增加（图3j），但丰富度没有显著变化（图3k）。这些数据表明，PTCV治疗导致外周T细胞的扩增，T细胞转运到肿瘤。

图3

作者还对疫苗接种后的外周血样本进行了单细胞RNAseq和TCRseq，以进一步表征疫苗诱导的T细胞反应。发现PTCV扩增的T细胞主要是CD8⁺TEM簇，其次是CD8⁺增殖簇，证明了疫苗接种驱动效应T细胞记忆克隆扩增。

然后验证两名代表性患者的肿瘤浸润T细胞的新抗原特异性活性。第一个患者外周血中有42个明显扩增的克隆，其中27个在治疗后的肿瘤样本中存在(图3g和4a)。在接种疫苗后肿瘤新出现的T细胞克隆中，3个最高频的TCR序列（图4b）主要在外周血单细胞测序的CD8⁺TEM簇中发现（图4c）。将这3条TCR序列克隆到pMXs-IRES（内部核糖体进入位点）-GFP（绿色荧光蛋白）逆转录病毒质粒载体中（图4d）。

用患者的PTCV特异性新抗原池刺激患者来源的PBMCs的TCR工程T细胞，以表征新抗原特异性细胞反应。发现T细胞活化（CD69⁺）与池1（由新抗原1-20对应的肽组成）相关，其中包括ELISpot检测到的最具反应性的表位；池2（由新抗原21-40对应的肽组成）作为特异性的内部对照，显示出与非特异性表位（CTA1）对照相似的水平（图4e）。

第二个患者中通过TCRseq/RNAseq鉴定出高频TCR，同样进行了工程设计。用包含患者PTCV中所有新抗原的表位池刺激工程TCR。与第一个患者相似，观察到CD4⁺和CD8⁺ T细胞对患者特异性新抗原的反应。这些数据验证了疫苗接种后的T细胞浸润和肿瘤中T细胞频率的增加，并对疫苗编码的新抗原具有特异性。

图4